этапов: выделение РНК подготовка мишеней и гибридизация микрочипов ана-лиз гибридизации микрочипов и подтверждение результатов гибридизации микрочипов количественной RT-PCR. Подробное описание метода представле-но в публикации (Lipina et al., 2012).


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
На
правах рукописи






Липина Татьяна Викторовна






ВКЛАД ТОЧЕЧНОЙ МУТАЦ
ИИ ГЕНА
DISC
1

(
DISRUPTED
-
IN
-
SCHIZOPHRENIA
-
1) В
ПАТОГЕНЕЗ
ШИЗОФРЕНИИ:
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИС
СЛЕДОВАНИЕ



03.03.01


Физиология



АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени


доктора биологических наук






Новосибирск

20
1
8





Работа выполнена в
Федеральном государственном бюджетном научном учр
е-
ждении Научно
-
исследовательском

институте физиологии и фундаментальной
медицины
(НИИФФМ) (г. Новосибирск).


Н
аучный

к
онсул
ь
тант
-



Та
мара Геннадьевна Амстиславская,

д
-
р биол
.

наук

О
фиц
и
ал
ь
ные
о
п
п
о
не
н
ты
:


Ирина Васильевна Мухина
,

д
-
р
биол
.

наук, профессор
, зав.
кафедрой нормальной физиологии
им. Н.Ю. Беленкова

и
директор института фундаментальной медицины ФГБОУ
ВО «Приволжский исследовательский медицинский униве
р-
ситет» Минздрава России

Алла Борисовна Салмина
,

д
-
р
мед
.

наук, профессор
,

гла
в-
ный научный сотрудник и руководитель НИИ молекулярной
медицины и патоби
охимии, заведующая кафедрой био
х
и-
мии ФГБОУ ВО "Красноярск
ого го
сударственн
ого

мед
и-
цинск
ого

университет
а

им
.
профессора В. Ф. Войно
-
Ясенецкого" Минздрава России

Анатолий Александрович
Овчинников
,

д
-
р мед
.

наук
, пр
о-
фессор
,

зав. кафедрой психиатрии, наркологи
и и психотер
а-
пии

ФГБОУ ВО

«
Новосибирского
г
осударственного
м
ед
и-
цинского
у
ниверситета
» Минздрава России

Ведущая

о
р
г
а
н
и
з
а
ция

-

Санкт
-
Петербургский
г
осударственный

у
ниверситет


Защита состоится

«
___

___________
20
18

года в



часов
на заседании
Д
и
с-
сертационного совета

Д
0
01
.0
14
.01

при ФГБНУ «Научно
-
исследовательский
институт физиологии и фундаментальной медицины» (630117, а/я 237, г. Нов
о-
сибирск, ул. акад. Тимакова
,
4), тел. 383
-
33598
01, факс 383
-
3359754, эл
.

почта
dissovet
@
physiol
.
ru



С диссертацией можно ознакомиться в

библиотеке НИИФФМ и на сайте
http
://
physiol
.
ru


Автореферат разослан

«
____

»


20
1
8

г.


Ученый секретарь


ди
ссертационного совета
,
д
-
р биол
.

наук




В.Н. Мельников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

РАБОТЫ

Актуальность темы исследования
.

Шизофрения является хроническим
психическим заболеванием, затрагивающ
им

~ 1% населения во все
м мире и х
а-
рактеризующим
ся нарушением когнитивных и эмоциональных функций. Сре
д-
ний возраст возникновения шизофрении у мужчин
-

18
-
25 лет, и у женщин


23
-
30 лет (
Tandon


al
., 2009).
Шизофрению
принято считать неизлечимым з
а-
болеванием, которое зачастую принимает затяжной характер. Поскольку пр
и-
чины возникновения шизофрении до конца не изучены, основная терапия
направлена на
купирование
существующих симптомов.

Анализ генетической архитектуры шизо
френии и механизмов её наслед
у-
емости доказал полигенный характер заболевания (Lewis, Levitt, 2002;
Howes


al
., 2017). В патогенез шизофрении критичный вклад привносят взаимодействия
определённых генетических элементов с психопатогенными факторами окр
у-
жаю
щей среды, что в целом нарушает формирование мозга и способствует в
дальнейшем проявлению симптомов шизофрении, которые, как правило, не
возникают до юношеского периода жизни (
Buka
,
Fan

1999; Lewis, Levitt, 2002).
Патологические механизмы на ранней стадии
развития, вовлечённые в до
л-
говременные процессы патогенеза шизофрении, до сих пор остаются неиз
у-
ченными. Одной из причин является отсутствие надежных биомаркеров для
ранней диагностики шизофрении и трудоемкость проведения долговреме
н-
ных клинических исследо
ваний до начала проявления симптомов шизофр
е-
нии. Только в последние годы стали появляться первые статьи с высокок
а-
чественной визуализацией головного мозга в процессе нейроразвития
-

до и
после возникновения шизофрении (
Zalesky


al
., 2015). В качестве
преве
н-
тивной терапии психозов и шизофрении был предложен вальпроат как мн
о-
гофункциональный препарат с более щадящим действием по сравнению с
антипсихотиками (
Lambert


al
., 2016). Отсутствие подходящих экспер
и-
ментальных моделей шизофрении, которые бы соот
ветствовали гипотезе
нейроразвития, также замедляет прогресс в данном направлении. Хотя с
у-
ществует ряд моделей с селективным разрушением определённых участков
мозга на ранней стадии развития, которые приводят к проявлению шиз
о-
френоподобного поведения после

полового созревания (
Moore


al
., 2006;
Tseng
, 2007), однако такой подход не моделирует в полной мере этиологию
шизофрении, поскольку не учитывается генетический компонент.

Выявляют около 130 генов
-
кандидатов, связанных с предрасположе
н-
ностью к шизофрен
ии, из которых только несколько подтверждены незав
и-
симыми исследованиями (
Ross


al
., 2006). Так,
DISC
1

(
Disrupted
-
In
-
Schizophrenia
-
1) ген был картирован на 1й хромосоме при цитогенетическом
анализе транслокации между 1 и 11 хромосомами (
t
1:11) среди член
ов шо
т-
ландской семьи больных шизофренией, депрессией и биполярным ра
с-
стройством (
Millar


al
., 2000). Затем, независимые гру
п-
пы исследователей выявили генетическую ассоциацию поврежденного гена
DISC1

с шизофренией в семьях из Финлян
дии (Ekelund et al., 2001; 2004),
Шотландии (Macgregor et al., 2004), Великобритании (Hamshere et al., 2005).
Многочисленные исследования обнаружили ассоциации однонуклеотидных
2






полиморфизмов гена
DISC1

с шизофренией на различных популяциях (Liu
et al., 200
6, обзор
Bradshaw
,

Porteous
, 2012,
Thomson


al
., 2013). Была с
о-
здана генетическая линия мышей с потерей С
-
конца
DISC
1, моделиру
ю
щей
укороченную изоформу
DISC
1 размером ~ 75 кДа при межхромосо
м
ной
транслокации у людей (
Li


al
., 2007). Данная линия
мышей продемо
н
стр
и-
ровала шизофреноподобные эндофенотипы вместе с депрессивно
-
подобным
поведением на фоне упрощения дендритных разветвлений нейронов в ги
п-
покампе. Следует отметить, что на начальном этапе, иссл
е
дования
DISC
1
были в основном сосредоточены на
функциональной роли С
-
конца
DISC
1,
поскольку место межхромосомной транслокации
t
1:11 пр
и
ходится на 9 э
к-
зон гена
DISC
1
, кодирующий С
-
конец протеина, в то время как функци
о-
нальная роль
N
-
конца
DISC
1 оставалась неизученной. В осно
в
ном были п
о-
лучены доказатель
ства, что С
-
конец
DISC
1 играет важную роль в нейрора
з-
витии. Так,
DISC
1
-
S
704 полиморфизм, ассоциированный с шиз
о
френией у
людей, подавляет нейрональную миграцию в коре головного мо
з
га в пр
о-
цессе нейроразвития (
Singh


al
., 2011). Кроме того, обнаружен п
о
вы
ше
н-
ный уровень
DISC
1 изоформы размером 75
-
85 кДа в клеточных ядрах у
больных шизофренией (
Sawamura


al
., 2005). Однако
была найдена ген
е
т
и-
ческая ассоциация между шизофренией, шизоаффективным расстройством и
дефицитом рабочей памяти для пациентов с гаплот
ипами, охватывающими 2
экзон
DISC
1

(Cannon et al., 2005; Hennah

al
., 2005;
Maeda


al
., 2006).

Также
было выявлено взаимодействие между С
-
концом
DISC
1 и
фосфодиэстеразой
4го типа (
PDE
4) (
Millar


al
., 2005).
PDE
4
,
а
та
кж
е

гликоген синтаз к
и
н
а
з
а
-
3
(
GSK
-
3)
являются внутриклеточными регуляторами а
к
тивности доф
а
м
и
новых
рецепторов 2го типа (
D
2)

(
Beaulieu et al., 2012
)
, к
о
т
о
рые л
е
жат в о
с
н
о
ве

д
о
ф
а-
миновой теории шизофрении (
Snyder
, 1976;
Н
owes
,
Kapur
, 2009
).
Уст
а
но
в
лено,
что
DISC
1 активно взаимодействует с

другими проте
и
нами, созд
а
вая ме
ж-
белковую сеть из 127 протеинов, включающих 158 вза
и
моде
й
ствий (
C
a-
margo


al
., 2007). Учитывая, что шизофрения явл
я
ется п
о
лиге
н
ным псих
и-
ческим заболеванием и риск развития данного ра
с
стройства определ
я
ется
взаимодействиями
между генетической предрасп
о
ложенн
о
стью и ср
е
дой, а
также взаимодействиями на геномном и протеин
о
вом уровнях, одним из н
о-
вых подходов изучения механизмов шизофрении явл
я
ется выявление вклада
нарушенных межбелковых взаимодействий в п
а
тог
е
нез шизофрении (
Nic
o-
demus


al
., 2010). Для реализации такого подх
о
да целесообразно и
с
след
о-
вание полиморфизма
DISC
1
, нарушающего вза
и
м
о
действия опред
е
лённых
протеинов с
DISC
1 на уровне
in

vivo

модели. О
д
н
а
ко, на момент инициации
данного исследования, экспериментальных
in

vivo

моделей для изучения
вклада межбелковых взаимодействий
N
-
конца
DISC
1 в механизмы шиз
о-
френии не существовало. Эти данные послужили основ
а
нием для г
и
потезы,
что генетическая модификация 2го экзона гена
DISC
1

у мышей, к
о
диру
ю-
щего
N
-
конец
DISC
1, позволит
оценить его вклад в ме
ж
белковые взаим
о-
действия и патогенез шизофрении на экспериме
н
тальной модели
in

vivo
.
Более того, 2й экзон
DISC
1
является наиболее дли
н
ным и, следов
а
тельно,
представляет собой оптимальную мишень для поиска точе
ч
ной м
у
тации,
3






вызванной х
имическим мутагеном
ENU

(
N
-
ethyl

N
-
nitrosourea
), ш
и
роко и
с-
пользуемого в экспериментальном подходе от «гена к поведению» (
Coghill


al
., 2002).

В связи с вышеизложенным,
целью
данной работы явилось исслед
о-
вание вклада гена
DISC
1

с
точечн
ой

мутаци
ей

во 2
м

экзоне
, модифициру
ю-
щей
N
-
конец белка,

в
механизм
ы

шизофрении на экспериментальной
in

vivo

модели
мышей
для выявления новых биомаркеров и терапевтических м
и-
шеней.

Для достижения цели были

поставлены следующие
задачи:

1.

Создать
генетические линии мышей с

измененным геном
DISC
1

путем
точечных мутаций во 2м экзоне и сравнить линии поведенческими мет
о-
дами для дальнейшего выявления шизофреноподобных характеристик

2.

Определить биохимические изменения

в головном мозге
, вызванные м
у-
тацией
(
DISC
1
Rgsc
1390
),
селективно приводящей к шизофреноподобному
поведению у мышей

линии
100Р/100Р
,

включая
показатели
дофаминерг
и-
ческ
ой

систем
ы

и
характеристики
вз
аимодействи
я

D
ISC
1 с
PDE
4
B
,
GSK
-
3
белками
и
D
2

рецепторами;



3.

Оценить антипсихотические эффекты
ингибиторов
PDE
4
B

и
GSK
-
3, а
также пептида ТАТ
-

D
2рер
, размыкающего
межбелковые взаимодействия

между
D
ISC
1
и

D
2
рецепторами;

4.

Оценить взаимодействие между генетической предрасположенностью к
шизофреноподобному поведению (100
P
/
+
) и фактором материнской и
м-
мунной активации для дальнейшей валидации патогенности
DISC
1
Rgsc
1390

мутации, а также оценить вклад интерлейкина
-
6 в генез
данного

типа патологического поведения
;

5.

Исследовать динамику возникновения эндофенотипов шизофреноподо
б-
ного поведения у мышей линии
100
P
/100Р, превентивную эффективность

вальпроата и молекулярную мишень, опосредующ
ую

данный эффект.


Основные положения, выносимые на защиту:

1.

Генетическая линия мышей 100P/100Р

с
точеч
ной

мутаци
ей

DISC
1

Rgsc
1390

во 2м экзоне гена
DISC1
,
созданная при
выполнении данной р
а-
боты,
соответствует основным критериям экспериментальной модели
шизофрении
, согласно этиологии; сходству симптомов
; нейробиологич
е-
ским изменениям

и

терапевтическому ответу на антипсихотики.

2.

Проявление шизофреноподобного поведения у 100
P
/100Р линии мышей
происходит на фоне гиперактивации

дофаминергической системы г
о-
ловного мозга, сопровождающейся увеличением: чувствительности к
амфетамину, плотности
высокочувствительных дофаминовых рецепт
о-
ров
D
2

(
D
2
high
)
; взаимодействия
D
ISC
1
-
L
100
P

с
D
2 рецепторами.

3.

Нарушение

взаимодействий
между
D
ISC
1
-
L
100
P

протеина

с
GSK
-
3,
PDE
4
B

и
D
2
рецепторами

вовлечено в биохимические механизмы
шиз
о-
френоподобного поведения. Коррекция повышенной активности
GSK
-
3,
PDE
4
B
, а также усиленных
взаимодействий

между

D
ISC
1
-
L
100
P

и

D
2

4






рецепторами
, оказывает антипсихотический эффект на шизофреноп
о-
добное поведение 100
P
/100Р мутантных мышей.

4.

Материнская иммунная активация посредством провоспалительного ц
и-
токина интерлейкина
-
6 (ИЛ
-
6) опосредует шизофреноподобное повед
е-
ние у г
етерозиготных мышей 100P/
+
.

5.

Глиатрансмиттер липокалин
-
2 (
Lcn
-
2) вовлекается в нейроглиальные м
е-
ханизмы шизофреноподобного поведения у 100P/100Р мышей
на ранней
стадии развития
и в превентивный эффект вальпроата.


Научная новизна полученных результатов
.
Впервые создана генетич
е-
ская линия мышей с точечной мутацией во 2м экзоне гена
DISC
1, приводящей к
замене лейцина на пролин в позиции 100 аминокислоты протеина
DISC
1
(название линии
D
ISC
1
-
L
100
P
; 100Р/100Р). Установлены следующие маркеры
шизофреноподобного
поведения у 100
P
/100Р мутантных мышей: гипреакти
в-
ность, нарушения престимульного торможения, латентного торможения и д
е-
фицит рабочей памяти. Данные показатели селективно нормализовались ант
и-
психотиком
-

клозапином, но не антидепрессантом
-

бупропионом.

Оц
енка анатомических изменений головного мозга с применением ма
г-
нитно
-
резонансной томографии выявила снижение обβёма мозга на 13%.

Данные биохимического анализа обнаружили пониженное связывание
D
ISC
1
-
L
100
P

протеина с фосфодиэстеразой
-
4В (
PDE
4
B
) и гликоген
-
с
интаз к
и-
назой
-
3 (
GSK
-
3), вместе с повышенным взаимодействием с дофаминовыми р
е-
цепторами 2го типа (
D
2). Сниженное взаимодействие
между
D
ISC
1
-
L
100
P

и

GSK
-
3 сопровождалось низким уровнем фосфорилирования
GSK
-
3, свидетел
ь-
ствуя о повышенной ферментативной актив
ности
GSK
-
3. Фармакологическое и
генетическое ингибирование
GSK
-
3 нормализовали шизофреноподобное пов
е-
дение 100
P
/100Р

мутантов. Впервые выявлено синергетическое взаимодействие
между фармакологическими
ингибиторами

PDE
4 и
GSK
-
3. С учетом того, что
GSK
-
3 акт
ивация зависит от стимуляции
D
2

рецепторов
, было предположено,
что
DISC
1 регулирует
функциональность
D
2

рецепторов

и
,

соответственно,
функционирование дофаминовой системы

головного мозга
. Впервые обнар
у-
жено наличие функционального взаимодействия между
DISC
1 и
D
2

рецептор
а-
ми
. Показано, что
взаимодействия

между
DISC
1

и
D
2

рецепторами

усилены как
в стриатуме постмортальных образцов больных шизофренией, так и на
генет
и-
ческой
модели
шизофрении
-

100
P
/100Р

линии мышей
.

Установлены антипсихотические свойства пепт
ида, размыкающего
ус
и-
ленные
взаимодействия

между
DISC
1

и
D
2
рецепторами,
корректируя шиз
о-
френоподобное поведение 100
P
/100Р

мышей.

Показано взаимодействие между генетической предрасположенностью к
шизофреноподобном
у поведению у гетерозиготных
100
P
/
+

мышей

и внутр
и-
утробной материнской иммунной активацией (МИА), а также вклад провосп
а-
лительного цитокина
,

интерлейкина
-
6 (ИЛ
-
6)
,

в патогенез шизофреноподобн
о-
го поведения на гибридной модели
-

100P/
+

x МИА, верифицируя патогенность
100
P

мутации.

5






На генетической м
одели 100
P
/100Р установлена отставленная манифестация
шизофреноподобного поведения в возрасте 12
-
16 недель. Хроническое введ
е-
ние вальпроата до начала проявления шизофреноподобного поведения у
100
P
/100Р

мышей предотвращало психопатологическое поведение. По данным
транскриптомного анализа
отделов

головного мозга идентифицирован
глиатрансмиттер липокалин
-
2

(Lcn2), вовлечённый в эффекты
100
P

мутации,
вальпроата и их совместном взаимодействии. Установлены дос
товерные корр
е-
ляционные сопряжения уровней Lcn2 с количеством астроцитов и сенсорно
-
моторной фильтрацией информации у 100P/100Р генетической линии мышей.
Данные корреляционного анализа указывают, что Lcn2 может являться молек
у-
лярным индексом ранней диагнос
тики шизофрении, а также терапевтической
мишенью для создания превентивной терапии данного заболевания.

Теоретическая и практическая ценность работы
.
Теоретическая и
практическая значимость работы определяется доказательством соотве
т-
ствия генетической лини
и 100P/100Р критериям модели шизофрении, во
з-
можности её использования для исследований молекулярно
-
клеточных и
нейробиологических механизмов шизофрении, связанных с нарушением
нейроразвития, а также дофаминергической системы головного мозга. И
с-
пользование
100P/100Р генетической модели шизофрении также полезно
для оценки эффективности терапевтических воздействий как в целях
предотвращения развития заболевания, так и его лечения. Выявленные в р
а-
боте эффекты PDE4, GSK
-
3 блокаторов и пептида ТАТ
-
D2pep демонстр
и-
руют терапевтический потенциал данных соединений в качестве будущих
антипсихотических препаратов. Разработана гибридная модель шизофрен
о-
подобного поведения, сочетающая в себе генетический
(100P/
+
)
и средовой
(
М
атеринская
И
ммунная
А
ктивация
)
факторы
и

котор
ая также может быть
использована в доклинических исследованиях шизофрении. Выявленная
взаимосвязь между Lcn2, уровнем астроцитов и проявлением шизофреноп
о-
добн
ого поведения

на генетической модели 100P/100Р указывает на ва
ж-
ность нейроглиальных взаимодействий

в патогензе данного заболевания, а
Lcn2 может быть предложен в качестве биомаркера
для дальнейших иссл
е-
дований в области разработки биомаркеров для ранней диагностики шиз
о-
френии и молекулярных мишеней для создания превентивной терапии.



Апробация
результатов
.
Результаты, полученные при выполнении диссе
р-
тационного исследования, представлены и обсуждены на: 10й международной
конференции по биоинформатике геномной регуляции и структу
р-
ной
\
системной биологии (BGRS
-
2016, Новосибирск,

Россия,

2016)
;

XII

м
ежд
у-
народном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и псих
о-
логии» (Судак,
Россия,
2016);
14м международном конгрессе по исследованиям
шизофрении (Флорида,

США,

2013)
;

международной конференции сообщества
«Стресс и поведение» (Петербург,
Росси
я,
2013)
;

м
еждународной конференции

NeuroDevNet

Brain

Development
” (Торонто,
Канада,
2012)
;

м
еждународной
конференции “

for

Neuroscience
” (Вашингтон,
США,
2011; Чикаго,
США,
2009)
;

м
еждународной конференции “
DISC
1
-
2010” (Эдинбург,
Шотла
н-
6






дия,
2010)
;

м
еждународной конференции “
Winter

Brain

Conference
” (Солт
-
Лэйк
Сити,
США,
2009)
;

м
еждународной конференции «
Neurons

and

Brain

Disease
»
(Торонто,
Канада,
2007).


Публикации
.
По материалам диссертации опубликован
ы

15 статей в
лице
н-
зируемых

журналах,
3
главы в книгах
,
по теме диссертации издана 1 книга под
редакцией автора
.



Структура и обβём работы.
Диссертация состоит из введения, обзора лит
е-
ратуры, описания материала и методов, результатов, обсуждения, заключения,
выводов и списка цитируемой литерату
ры, содержащей 5
6
7

источник
ов
. Работа
изложена на 2
1
9

страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 45 р
и-
сунков и 1 приложения.


Личный вклад автора
.
В цикле исследований, составляющих диссертац
и-
онную работу, автору принадлежит решающая роль в выборе

направления и
с-
следований, разработке экспериментальных подходов, в анализе и обобщении
полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад
автора заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования


от постановки зад
ачи и проведения экспериментов, до анализа, обсуждения и
оформления всех полученных результатов.



Благодарности
.
Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Амст
и-
славск
ой

Т.Г. за поддержку и помощь в написании диссертации. С особой пр
и-
знательностью авт
ор благодарит научных сотрудников Научно
-
Исследовательского Института им. Люненфельда
-
Таненбаума

и

Университета
г.
Торонто за плодотворную совместную работу: проф. Дж
она

Родера


за по
д-
держку и обсуждение научных результатов; к.б.н. Стивена Клапкота


за и
н
и-
циацию сотрудничества с биоресурсом
RIKEN
;

проф. Майлса Хуслей


за
оценку межбелковых взаимодействий
DISC
1 х
PDE
4
B
, используя
HEK
293 кл
е-
точную линию;


проф.

Альберта Вонга


за
помощь в проведении

транскри
п-
томного анализа;

проф.

Фэнг Лью и к.б.н.
Шупенга Ли


за оценку межбелк
о-
вых взаимодействий и создание пептида, размыкающего
Disc
1
xD
2
межбелк
о-
вые
взаимодействия; проф. Джеймса Вудгета и к.б.н. Оксану Кайданович
-
Бейлин


за

помощь

с анализом

Disc
1
x

GSK
-
3 межбелковых взаимодействий;
проф. Ану Мартин
ез


за предоставление фармакологического
GSK
-
3 блокат
о-
ра и обсуждение научных результатов; проф. Ину Вейнер


за обсуждение р
е-
зультатов, полученных методом латентного торможения.

Обβекты и методы исследования

Экспериментальные животные

В исследовании были

использованы самцы
генетических
линий
DISC
1
-
Q
31
L

(гомозиготные мыши 31
L
/31
L
)
,
DISC
1
-
L
100
P

(гомозиготные мыши
100
P
/100
P
)

и самцы дикого типа (инбредная линия
C
57
B
L
/6
NCrl
;

wild
-
type
;

WT
; +/+
). Данные генетические линии были получены при
выполнении данной
7






работы в
сотрудничестве с лабораторией профессора Д. Родера (г.Торонто, К
а-
нада) и центром RIKEN (Япония).
2й э
кзон гена
DISC
1

был скринирован в це
н-
тре RIKEN (Япония) на выявление точечных мутаций у 1686 животных
1го

п
о-
коления, полученных от скрещивания сам
цов линии C57BL/6JJcl, которым был
введен химический мутаген N
-
-
N
-
nitrosourea

(ENU),
с сам
к
ами

линии
DBA/2JJcl без введения ENU химического мутагена (Coghill et al., 2002). Было
обнаружено 2
миссенс
-
мутации: 1
я

мутация
DISC
1

Rgsc
1393

приводила к замене
нуклеотида Аденин на нуклеотид Тимин в 127м триплете C
A
G. В результате
такой замены произошла замена аминокислоты Глутамин (
Q
) на Лейцин (
L
),
кодируемых данными триплетами в позиции 31
й

аминокислоты
DISC
1 проте
и-
на (
DISC
1
-
Q
31
L
). 2
я

мутац
ия
DISC
1

Rgsc
1390
приводила к замене нуклеотида
Тимина на нуклеотид Цитозин в 334м триплете CТС. В результате такой зам
е-
ны произошла замена аминокислоты Лейцин (
L
) на аминокислоту пролин (Р),
кодируемы
е

данными триплетами в позиции 100 аминокислоты
DISC
1 п
роте
и-
на (
DISC
1
-
L
100Р). Второй экзон гена
DISC
1

идентичен у C57BL/6JJcl и
DBA/2JJcl родительских инбредных линий мышей, подтверждая возникновение
выявленных 2х точечных мутаций в результате действия
ENU

мутагена. Гет
е-
розиготные мыши 2го поколения (
N
2), полу
ченные в результате скрещивания
гетерозиготных самцов
Q
31
L
+/
-

и 100Р
+/
-

1го поколения с самками дикого типа
C57BL/6JJcl, подвергались обратному скрещиванию с самками дикого типа
C57BL/6JJcl
4

поколения (
N
3
-
N
6). Затем гетерозиготы с преобладающим ген
е-
тическим фоном от
C
57
BL
/6
J

(98.4375% у
N
6 поколения) скрещивались между
собой для получения гомозиготных (31
L
/31
L
; 100
P
/100
P
), гетерозиготных
(31
L
/
+
; 100
P
/
+
) и гибридных (31
L
/100
P
) мышей. Гетерозиготные мыши обеих
линий в дальнейшем также подвергались обра
тному скрещиванию до 10
-
15го
поколения для элиминирования дополнительных мутаций. Генотипирование
31
L

мутации осуществлялось согласно ПЦР протоколу с использованием пра
й-
меров:
F
: 5´
-
GGC

ACC

AAC

TTT

CTT

TTG

GT
-
3´ и
R
: 5´
-
ACA

AGG

GAG

CTC

TTG

AGA

AAA
-
3´. 100
P

мутацию генотипировали, используя праймеры:
F
, 5´
-
AGA

CCA

GGC

TAC

ATG

AGA

AGC
-
3´ и
R
: 5´
-
AAG

CTG

GAA

GTG

AAG

GTG

TCT
-
3´.



В эксперименте использованы гетерозиготные, гомозиготные мыши двух
DISC
1
генетических линий (31
L
/31
L
, 100
P
/100
P
) и мыши дикого типа

(+/+ или
C57Bl/6NCrl), в возрасте 2.5
-

4 мес., полученные из разведения гетерозиготных
пар. Мыши содержались в виварии в стандартных пластиковых клетках по 5
животных. В экспериментальной комнате был установлен регулярный световой
режим 12:12 (свет с 9:0
0 часов: темнота с 21:00 часов) и поддерживалась те
м-
пература около 23
о
С. Пищу (гранулы (
Purina

mouse

chow
)) и воду животные п
о-
лучали в неограниченном количестве. Все экспериментальные процедуры были
одобрены этическим комитетом
института, в котором
выполнялось исследов
а-
ние.


Поведенческие тесты

Эксперименты проводили с 9 утра до 17 часов вечера. Субβективные т
е-
сты (например, тест «Приподнятого крестообразного лабиринта», «социальная
мотивация и распознавание», «
принудительное

плавание») записывали н
а в
и-
8






део
, и затем

в
идео материалы анализировали с помощью программы (
Obs
er
ver

5.0,
Noldus

Information

Technology
,
).
Протоколы поведенческих м
е-
тодик подробно описаны в статьях (
Clapcote
,
Lipina


al
.,

2007).


Эмоционально
-
тревожное

поведение

оценивали в тестах «
Открытое п
о-
ле»,

Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ)
.

«Поведенческое отчаяние»
оценивали в т
есте «принудительного плавания». Ангедония
-
подобные проце
с-
сы выявляли с помощью теста
«
Предпочтение сахарозы
»
, где мышам предл
а-
гался свобо
дный выбор между бутылочкой
с водой и 5% раствором сахарозы.

Анализ
социального поведения

проводили с помощью т
еста «Социальная
мотивация и социальное распознавание»
. Вкратце,

т
естирование состояло из
трех сессий, между сессиями мышь возвращалась в домашнюю клетку на 1
-
2
минуты: 1.
Адаптация
.

Мышь помещали в экспериментальную установку на 5
минут. 2.
Сессия 1 («Социальная мотивация»)
.

В один из полых цилиндров п
о-
мещали «партнёра
1» (незнакомая мышь дикого типа, того же пола, возраста и
веса, что и тестируемое животное), в другой цилиндр помещали нейтральный
предмет без запаха и вкуса). Тестируемая мышь помещалась в центр установки
и регистрировали продолжительность и число заходов

в каждый отсек устано
в-
ки в течение 10 минут. 3.
Сессия 2 («Социальное распознавание»)
. Затем
нейтральный предмет заменяли второй незнакомой мышью («партнёр 2»
-

мышь дикого типа, того же пола, возраста и веса, что и тестируемое животное).
Соответственно,
в сессии 2 тестировали реакцию животного в ответ на уже зн
а-
комого «партнёра 1» и нового «партнёра 2» в течение 10 минут.

Когнитивное поведение

оценивали в таких тестах как 1)
Престимульное
торможение акустической реакции вздрагивания

(
PPI
);
2) Латентное
тормож
е-
ние памяти страха
;

3)
T
-
образный лабиринт и 4)

долговременное простра
н-
ственное обучение и память в
в
одн
ом

лабиринт
е

Морриса.

Подробное описание
методов представлено в публикациях (
Clapcote
,
Lipina


al
.,

2007;
Lipina


al
.,

2012)


Биохимические
методы

Вестерн блоттинг
.

Мышь декапитировали, выделяли на льду необход
и-
мые отделы головного мозга и хранили при


80
ο
С для дальнейших биохимич
е-
ских исследований. В день эксперимента ткань головного мозга гомогенизир
о-
вали в
RIPA

буфере (
Santa

Cruz

Biotechno
logy
) содержащим физиологический
раствор забуференный
Tris
, 1%
Nonidet

P
-
40, 0.5% дезоксихолат натрия, 0.1%
SDS

(додецил сульфат натрия), 0.004% азид натрия,
PMSF

(
фенилметилсул
ь-
фонилфторид
),
ортованадат натрия, смесь ингибиторов
протеаз (
Roche

Applied

Science
) и фосфотаз (
Sigma
), затем центрифугировали при 10

000 об/мин 10 мин
при 4
ο
С. Концентрацию протеинов определяли в супернатанте по Брэдфорду
(
Protein

Assay
,
BioRad
). Супернатанты хранили при
-
80
ο
С до проведения в
е-
стерн блоттинга. Равное количество п
ротеинов (20
-
40 мкг) кипятили в буфере
Лэммли, затем для разделения денатурированных протеинов проводили эле
к-
трофорез в 10
-
15% полиакриламидном геле и осуществляли перенос протеинов
на ПВДФ (поливинилидендифторид
)
мембрану (
Life

Sciences
). Блокирование
неспецифичных связываний осуществлялось при помещении мембраны в ра
з-
9






бавленный раствор бычьего сывороточного альбумина с небольшим содерж
а-
нием детергента
Tween

20. После блокирования на мембрану наносился раствор
первичных антител для инкубации в течение 10
-
12 часов при 4
ο
С. Использов
а-
ли

следующие

антитела
:
anti
-
phospho
-
GSK
-
3a/b Ser21/9 (1:1000, Cell Signaling
Technology); anti
-
GSK
-
3
β

(1:1000, Invitrogen), anti
-
GSK
-
3a (1:1000, Cell Signaling
Technology,
anti
-
D2R (
1:200,
Santa Cruz Biotechnology)
,
anti
-
LCN2 (
1:1000, Santa
Cruz
Biotechnology
), anti
-
β
-
catenin (1:2000, BD Biosciences), anti
-
GAPDH
(1:10,000, Abcam).
Детекцию осуществляли с помощью вторичных антител,
связанных с пероксидазой хрена и хемилюминесцентного реагента (
ThermoSc
i-
entific
) и анализировали с
помощью денситометрического метода, используя
ImageJ

программу. Данные нормализовали к
β
-
catenin

или
GAPDH
.

Коиммунопреципитаци
ю
проводили согласно протоколу, описанному
раннее (
Lipina


al
.,

2011).

Высоко
эффективная
жидкостная хроматография (В
Э
ЖХ)
, определение
плотности высокочувствительных дофаминовых рецепторов
D
2
high
,
а также

in

vivo

м
икродиализ

выполнял
и
сь как описано ранее (
Lipina


al
.,

2010
;
Niwa


al
.,
2010).

Определение цитокинов

проводилось

иммуноферментным анализом
ELISA

как описано ранее (
Lipina


al
.,

2013).


Анализ экспрессии генов с помощью микрочипов

состоял из нескольких
этапов: выделение РНК; подготовка мишеней и гибридизация микрочипов
; а
н
а-
лиз гибридизации микрочипов
;
и подтверждение результатов гибридизации
мик
рочипов количественной
RT
-
PCR
. Подробное описание метода представл
е-
но в публикации (
Lipina


al
.,

2012).

Иммуногистохимия
.

После анестезией пентобарбиталом (120 мг/кг) м
ы-
шей перфузировали 4% раствором периодата
-
лизиниа
-
параформальдегидом
при 4
ο
С. Затем де
лали сагиттальные срезы парафиновых образцов мозга 5 мм
толщиной, де
-
парафинировали срезы при обработке ксиленом и регидрировали
этанолом. После блокировки срезов раствором
Dako
, срезы инкубировали с
первичными антителами в течение 15 часов (метка для делящихся клеток
-

ra
b-
bit

anti
-
ki
67,
Lab

Vision
, 1:200; метка для нейронов
-

anti
-
NeuN
,
Chemicon
, 1:200;
метка для глиальных клеток
-

anti
-
GFAP
,
COVANCE
, 1:200), затем проводили
инк
убацию с вторичными антителами (
goat

anti
-
rabbit

IgG
,
Vector

Labs
, 1:200) и
третичными антителами (
ABC
,
Vector

labs
, 1:50). Детекцию
DAB

окраски (к
о-
ричневый цвет) регистрировали с помощью микроскопа
Aperio

ScanScopeXT

(
Aperio

Technologies
,
USA
). Апоптоз оц
енивали с помощью метки
TUNEL

(
Roche

Applied

Science
), используя инструкцию производителя. Меченные
клетки идентифицировали и анализировали с помощью программы
Aperio

I
m-
ageScope
.

Конфокальная микроскопия.

После анестезии и перфузии, как описано
выше, выде
ляли головной мозг, помещали в 4% параформальдегид (ПФА) на 24
часа и нарезали 100 мкм сагиттальные срезы на вибратоме. Затем срезы мозга
помещали в 4% раствор бычьего сывороточного альбумина, 0.1% Тритон
-
Х
100, натрий
-
фосфатный буфер на 15 минут. П
е
рвичны
е антитела (
rabbit

anti
-
10






LCN
2
polyclonal
,
Santa

Cruz

Biotechnology
, 1:100 и
mouse

anti
-
GFAP

(1:250) и
н-
кубировали как свободно плавающие срезы 48 часов при 4
ο
С. Затем срезы пр
о-
мывались 3 раза по 10 минут в растворе блокирующим перм
е
абилизацию и и
н-
кубировали
со вторичными антителами (
rabbit

LCN
2
-
CY
5, 1:200 или
mouse

GFAP
-
CY
2, 1:200) 2 часа при 20
ο
С. После инкубации срезы промывали (3 х 10
мин), и фиксировали на стекло для приготовления слайда. Все меченые срезы
просматривали на конфокальном микроскопе (
Zeiss

L
SM

510), и анализиров
а-
лись, используя программу
Nikon

EZ
-
C
1
FreeViewer

v
3.9.
Для количественной
оценки использовали 3
-
5 мышей на генотип и 4 среза на мышь.

Фармакологические препараты

Клозапин (3 мг/кг;
Tocris
), галоперидол (0.4 мг/кг, 0.8 мг/кг;
Tocris
),
TDZD
-
8 (2.5 мг/кг, 7.5 мг/кг, 15 мг/кг) растворяли в физиологическом растворе,
содержащим 0.3%
Tween

20 (
BioRad
). Бупропион (4 мг/кг;
Sigma
) растворяли в
дистиллированной воде. Ролипрам (0.5 мг/кг;
Sigma
) растворяли в физиолог
и-
ческом растворе, содержаще
м 10%
DMSO
.
D
-
амфетамин сульфат (0.5 мг/кг, 1.0
мг/кг, 2.5 мг/кг, подкожно,
Sigma
-
Aldrich
,
Oakville
,
Ontario
,
Canada
; дозы ра
с-
считывали как соединение соли), вальпроат (200 мг/кг) растворяли в физиол
о-
гическом растворе. Все п
репараты приготавливали в день э
ксперимента и вв
о-
дили интраперитонеально (за исключением амфетамина, который вводили по
д-
кожно) в обβеме 10 мл/кг. Используемые препараты вводили за 30 минут до т
е-
стирования, за исключением
TDZD
-
8, который вводили за 5 минут до тестир
о-
вания, и амфетамина, к
оторый вводили непосредственно перед тестированием.
Доза клозапина была выбрана на основе литературы (
Lipina


al

2005). Дозы
галоперидола, бупропиона, ролипрама,
TDZD
-
8 и вальпроата были выбраны с
о-
гласно ранее опубликованных исследований на мышах (
David


al
., 2003;
Egashira


al
., 2005;
Pouzet


al
., 2005;
Zhang


al
., 2002;
Beaulieu


al
., 2004;
Tremolizzo


al
.,

2005). При оценке эффектов препаратов в тесте латентного
торможения, их вводили перед двумя сессиями


пре
-
экспозицией и обуславл
и-
ванием
. В тесте «Вынужденного плавания» ролипрам вводили 8 дней и за 30
мин перед тестированием. Вальпроат вводили дважды в день в течение 14 дней
(
Tremolizzo


al
.,

2005).

Введение
PolyI
:
C

и антител к интерлейкину
-
6 (ИЛ
-
6):

PolyI
:
C

(в форме
соли натрия;
Sigma
-
Aldrich
) растворяли в буфере
PBS

(5 мг/кг и 2.5 мг/кг) и
вводили в хвостовую вену при слабом физическом ограничении движения в
обβёме 5 мл/кг. Экспериментальным животным (самки
WT

и 100
P
/100
P

на 9
день беременности) внутривенно вводили 2.5 мг/кг
р
olyI
:
C
,
часть животных п
о-
лучала также совместно с р
olyI
:
C

100 мкг антител к ИЛ
-
6 (
anti
-
IL
-
6;
rat

IgG
1;
R
&
D

Systems
) свежерастворенных в 200 мкл
PBS

(
Smith


al
., 2007).
Контрол
ь-
ные животные получали введение 200 мкл
PBS
.


Статистика

Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ
Statistica10. Поведенческие данные были проанализированы с помощью
одно
-

и
двухфакторного анализа ANOVA, с повторными измерениями, где необходимо,
и дальнейшим ретроспективным (post
-
hoc) а
нализом (LSD критерий Фишера).
Морфометрические данные анализировали с помощью
t

-
критерия Стьюдента.

11






РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание двух генетических линий мышей с точечными мутациями во
2м экзоне гена
DISC
1

Ген
DISC
1

состоит из

13 экзон
ов
, среди
которых 2 экзон является самым
длинным
, он
представлен во всех известных изоформах
DISC
1

и кодирует о
с-
новную часть «головного» домена белка
DISC
1 (
Millar


al
.,

2005). При сотру
д-
ничестве с биоцентром
RIKEN

был отсканирован 2 экзон
гена
DISC
1

на мут
а-
ции у
1681 самцов
-
потомков 1го поколения, полученного от скрещивания
ENU
-
мутагенизированных С57
BL
/6
JJcl

самцов с
DBA
/2
JJcl

самками, которые не п
о-
лучали введения
ENU

мутагена. Мутантный транскрипт
DISC
1
Rgsc
1393

имел
127А


Т трансверсию (Рис.
1
А), что приводило к

замене аминокислоты глут
а-
мин (
Q
) на лейцин (
L
) в позиции 31 аминокислоты протеина
DISC
1. В то время
как мутантный транскрипт
DISC
1
Rgsc
1390

имел 334Т


С трансверсию (Рис.
1
Б),
вызывая замену аминокислоты лейцин (
L
) на пролин (
P
) в позиции 100 амин
о-
кисло
ты протеина
DISC
1. Последовательность 2 экзона у мышей линии
С57
BL
/6
JJcl

и
DBA
/2
JJcl

идентична, предполагая, что обе точечные мутации
возникли вследствие введения
ENU

мутагена. Затем, гетерозигот
N
2, потомки
скрещивания выявленных самцов
-
мутантов
Q
31
L

и
L
1
00
P

с самками дикого
типа
C
57
BL
/6
JJcl
, скрещивали с мышами
C
57
BL
/6
J

инбредной линии в течение
4х поколений (
N
3
-
N
6)
для максимального

соответств
ия генома

C
57
BL
/6
J

и
н-
бредной линии

(
геном
N
6 поколения на 98.4375%

соответствует
C
57
BL
/6
J

и
н-
бредной линии
)
. Гетерозиготы
6
го поколения скрещивали между собой для с
о-
здания гомозиготных (31
L
/31
L
; 100
P
/100
P
), гетерозиготных (31
L
/
+
; 100
P
/
+
) и
гибридных (
Q
31
L
\
L
100
P
) мышей, для дальнейшего фенотипирования. Живо
т-
ные всех исследуемых генотипов жизнеспособны и не разли
чимы от мышей
дикого типа по морфо
-
анатомическим признакам.















Рис. 1
. Хромотограмма ДНК последовательности, показывающая точечные м
у-
тации во 2м экзоне гена
DISC
1.
А.

Трансверсия 127А


Т меняет кодон
CAG
,
кодирующий глутамин (
Gln
) на кодон
CTG
, кодирующий лейцин (
Leu
) в поз
и-
ции 31 а.к.
DISC
1 белка.
Б.

Трансверсия 334Т


конвертирует кодон СТС, код
и-

А

Б

12






рующий лейцин (
Leu
) на кодон ССС, кодирующий пролин (
Pro
) в позиции 100
а.к.
DISC
1 протеина
.



2.
Шизофреноподобное
поведение 100
P
/100
P

линии мышей

Гиперактивность в тесте «Открытое поле»
.
ANOVA

с повторными и
з-
мерениями выявил достоверное влияние генотипа [
F
(4,48) = 4.0;
p

< 0.01] и
временных интервалов [
F
(5,240) = 6.7;
p

< 0.001] на горизонтальную активность
в данном
тесте. Горизонтальная двигательная активность была выше у
100
P
/100
P

мутантов на протяжении всех 30 минут (
p

< 0.05 на 10
-
15, 20
-
25 и 25
-
30 минуты по сравнению с мышами дикого типа) (Рис.
2
А). Животные всех
остальных генотипов не отличались по данному показ
ателю от
WT

мышей.

Дефицит престимульного торможения реакции вздрагивания (
PPI
)
.
ANOVA

с повторными измерениями выявил достоверный эффект

престимулов
[
F
(2,240) = 4.9;
p

< 0.01], генотипа [
F
(5,120) = 11.2;
p

< 0.001 и их взаимоде
й-
ствий [
F
(10,240) = 2.7;
p

< 0.01] на процент престимульного торможения реа
к-
ции вздрагивания. Дефицит престимульного торможения наблюдался у мышей
31
L
/31
L
, 100
P
/+, 100
P
/100
P

и 31
L
/100
P

генотипов по сравнению с контрольн
ы-
ми животными дикого типа (Рис.

).
ANOVA

также обнаружил досто
вернй
эффект генотипа на интенсивность реакции вздрагивания без престимулов
[
F
(5,120) = 4.7;
p

< 0.001], которая была ниже у мышей 100
P
/+, 100
P
/100
P

и
31
L
/100
P

генотипов по сравнению с
WT

мышами. Корреляционный анализ не
выявил достоверной зависимости проц
ента престимульного торможения реа
к-
ции вздрагивания от интенсивности вздрагивания (
r

= 0.16;
p

= 0.14). Дефицит
престимульного торможения у 100
P
/+ и 100
P
/100
P

мышей не связан с наруш
е-
нием слуха, поскольку порог слуховой реакции ствола головного мозга у
100
P
/100
P

мышей (40 ± 2.6) не отличался от мышей дикого типа (46 ± 5.1).

Дефицит латентного торможения памяти страха
.
Мыши изучаемых г
е-
нотипов не отличались от контрольных животных по питьевому поведению во
время сессии приучения животных к питью в оперантно
й камере, а также по
скорости выполнения 25
«слизываний»

(50
-
75) перед подачей обусловленного
тона в день тестирования

(
p

s

� 0.05;
общее среднее значение «А периода» =
7.35 сек.)
.
MANOVA

выявил достоверный эффект фактора пре
-
экспозиции
(ПЭ) к тону [
F

(1,96) = 11.2;
p

< 0.001], а также генотипа [
F

(4,96) = 4.2;
p

0.01]
на соотношение А/Б

(коэффициент подавления питья)
. Дефицит латентного
торможения продемонстрировали 31
L
/31
L
, 100
P
/+ и 100
P
/100
P

линии мышей
(Рис.
2
В
), однако память страха (замирание в

ответ на обусловленный тон и
увеличение времени выполнения 25
«слизываний»
) проявили экспериментал
ь-
ные мыши без пре
-
экспозиции (БПЭ) всех генотипов, исключая общие когн
и-
тивные нарушения.

Дефицит рабочей памяти в «Т
-
образном лабиринте»
.
ANOVA

выявил д
о-
сто
верный эффект генотипа [
F

(2,22) = 7.56;
p

< 0.01] на выбор правильного р
у-
кава лабиринта. 100Р/100Р мутанты требовалось существенно больше времени,
чем мышам дикого типа и 31
L
/31
L
, чтобы осуществлять правильный выбор в
70% ежедневных тренировок в т
ечение 3
х последовательных дней
.
ANOVA

13






выявил достоверное влияние генотипа [
F

(2,22) = 9.6;
p

< 0.001] на выбор пр
а-
вильного рукава лабиринта. Мутантные мыши 31
L
/31
L

и 100
P
/100
P

существе
н-
но реже выбирали правильный рукав Т
-
лабиринта при кратковременных инте
р-
валах (
5 сек. и 10 сек.) по сравнению с мышами дикого типа (Рис.
2
Г
), однако
не отличались от контрольных животных по данному показателю при 30 сек.
интервале.

Пространственное обучение и память в тесте «Водный лабиринт Морр
и-
са»
.
ANOVA

с повторными измерениями не обнаружил достоверного влияния
генотипа как на латентный период нахождения платформы
во время обучения
,
так и на процент времени, проведенном в сегменте, где накануне находилась
плат
форма во время тестирования

(
p

s

� 0.05)
.





Рис. 2.

Мыши линии 100Р/100Р проявляют:
А
.

гиперактивность в тесте «открытое поле»;
Б
.

дефицит пре
-
стимульного торможения;
В
.

Дефицит латентного торможения памяти
страха, которое выражается в разнице коэффициента подавления питья между экспер
и-
ментальной группой с пре
-
экспозицей к тону (ПЭ) по сравнению с группой без пре
-
экспозиции (БПЭ) (**
-

p

0.01


по сравнению с ПЭ внутри
генотипа; ###
-

p

0.001


по сравнению с ПЭ мышей дикого типа) и
Г
.

дефицит рабочей памяти в Т
-
образном л
а-
биринте при использовании 5 сек., 10 сек. и 30 сек. интервалов перед выбором рукава л
а-
биринта. 50% выбор является случайным. *
-

p

0.05; **
-

p



0.01; ***
-

p

0.001


по
сравнению с мышами дикого типа (+/+).


А

Б



В

Г


14






3.
Депрессивно
-
подобное поведение 31
L
/31
L

линии мышей

Повышенное «поведенческое отчаяние» в тесте «Принудительного пл
а-
вания».
ANOVA

выявил достоверное влияние генотипа [
F

(4,86) = 3.3;
p

0.05].
Продолжительность дрейфа в данном тесте была выше у 31
L
/31
L

мышей (Рис.
3
А) по сравнению с контрольными животными.

Дефицит социальной мотивации и социального распознавания.
ANOVA

с
повторными измерениями выявил достоверное влияние генотипа [
F

(4, 28) =
9.6;
p

< 0.001] и присутствие «партнёра 1» [
F

(1,28) = 4.1;
p

< 0.01] на время
пребывания воз
л
е отсека с «партнёром 1». Мыши 31
L
/+ и 31
L
/31
L

генотипов
проводили одинаковое количеств
о времени как возле пустого отсека установки,
так и возле отсека с «партнёром 1» (Рис.
3
В
), в то время как мыши дикого типа
и 100
P
/+ и 100
P
/100
P

генотипов продемонстрировали предпочтение «партнёра
1».
ANOVA

c

повторными измерениями обнаружил существенное в
лияние г
е-
нотипа [
F

(4,28) = 7.9;
p

< 0.001], присутствие незнакомого «партнёра 2» [
F

(1,28) = 5.9;
p

< 0.05] и также их взаимодействия [
F

(4,28) = 4.8;
p

< 0.01]. М
у-
тантные мыши 31
L
/+ и 31
L
/31
L

генотипов в равной степени проявили интерес к
знакомому «партн
ёру 1» и новому «партнёру 2 (Рис.
3
Г
), в то время как мыши
дикого типа и 100
P
/+ и 100
P
/100
P

генотипов предпочитали больше времени
оставаться возле «партнёра 2».

Дефицит предпочтения 10% сахарозы.
ANOVA

обнаружил достоверное
влияние генотипа [
F

(2,17) = 2
8.4;
p

< 0.001], дня тестирования [
F

(3,51) = 5.4;
p

< 0.01] и их взаимодействий [
F

(6,51) = 8.4;
p

< 0.001] на предпочтение сахар
о-
зы. 31
L
/31
L

мыши существенно меньше потребляли 10% раствор сахарозы, чем
мыши дикого типа или 100Р/100Р, начиная со 2го дня тестирования (Рис.
3
В
).





















А

Б

В

Г

15











4.

Фармакологические эффекты антидепрессантов и ан
типсихотиков на
поведение
3
1
L
/31
L

и 100
P
/100Р

линий мышей

Влияние клозапаина (3 мг/кг), галоперидола (0.4 мг/кг), бупропиона (4
мг/кг), ролипрама (0.5 мг/кг) на дефицит престимульного торможения у
DISC
1

мутантных мышей

MANOVA

идентифицировал влияние генотипа [
F

(4,290) = 23.4;
p


0.001], фармкологических препаратов [
F

(4,290) = 6.2;
p

< 0.001] и их взаим
о-
действий [
F

(16,290) = 5.2;
p

< 0.001] на престимульное торможение реакции
вздрагивания. Как оказалось, антипсихотики не о
казали действия на дефицит
престимульного торможения у линии 31
L
/31
L
, в то время как клозапин и гал
о-
перидол существенно улучшали нарушение престимульного торможения у л
и-
нии 100
P
/100
P

(
p

< 0.01 и
p

< 0.001, соответственно (Рис
.

4
). В то время как
введение
ролипрама 100Р
/
+

и 100Р/
100Р полностью восстановило их дефицит
престимульного торможения до контрольного уровня.




Рис.
3.

Депрессивно
-
подобное поведение мышей линии 31
L
/31
L

в тестах:
А
.

«Принудительного плавания»;
Б
.

«Предпочтение к сахарозе»,
В
.

Социальная м
о-
тивация и Г) Социальное распознавание. *
-

p

0.05; **
-

p

0.01


по сравнению
с мышами дикого типа (+/+).



Рис. 4.

Фармакологическая эффективность антипсихотиков, антидепрессантов и
ролипрама на дефицит престимульного

торможения реакции вздрагивания у
DISC
1 мутантных мышей и мышей дикого типа (+
\
+). Данные представлены в в
и-
де среднего значения трех престимулов для каждой экспериментальной группы
+
\
+ (
n

= 11
-
16); 31
L
/+ (
n

= 10
-
24); 31
L
/31
L

(
n

= 10
-
16); 100
P
/+ (
n

= 10
-
22
);
100
P
/100
P

(
n

= 11
-
17). *
-

p

0.05; **
-

p

0.01; ***
-

p

0.001


по сравнению с
введением физ. р
-
ра внутри каждого генотипа; ##
-

p

0.01; ###
-

p

0.001


по
сравнению с +
\
+ мышами на фоне введения физ. р
-
ра.


16






Влияние антидепрессанта
-

бупропион (4 мг
\
кг) и ролипрама (0.5 мг
\
кг) на д
е-
прессивно
-
подобное поведение мышей линии 31
L
/31
L

MANOVA

выявил достоверное влияние генотипа [
F
(1,38) = 10.6;
p


0.001] и препаратов [
F

(2,38) = 5.1;
p

< 0.01] на продолжительность дрейфа в т
е-
сте «Принужденн
ое плавание». 31
L
/31
L

мутантные мыши на фоне введение
физ. раствора продемонстрировали повышенную продолжительность имм
о-
бильности (
p

<0.01) по сравнению с контрольными животными (Рис.
5
). Введ
е-
ние бупропиона достоверно снижало продолжительность дрейфа у мы
шей л
и-
нии 31
L
/31
L

(
p

< 0.01), в то время как введение бупропиона и ролипрама сн
и-
жало иммобильность у мышей дикого типа (
p

s

0.05).



























Таким образом, фармако
-
поведенческий анализ выявил шизофреноп
о-
добное поведение у мышей линии 100
P
/100Р

и депрессивно
-
подобное пов
е
д
е-
ние у 31
L
/31
L

мутантных животных. Следовательно, можно предполо
жить, что
дей
ствие

каждой точечной мутации во 2
-
м экзоне гена
DISC
1
, по
-
видимому,
вызывает
специфичные биохимические
изменения, приводящие к тому или
иному типу психопатологии.

Поэтому на следующем этапе ис
следования пре
д-
ставлялось важным
исследовать

биохимические особенности, приводящие к
шизофреноподобному поведению у мышей линии 100
P
/100Р
.





Рис.
5
.

Фармакологический эффект бупропиона (острое введение) и р
о-
липрама

(введение в течение 8 дней) на «поведенческое отчаяние» у
31
L
/31
L


мутантных мышей и мышей дикого типа (+
/
+). +
/
+ мыши на фоне
физ. раствора, бупропиона и ролипрама (
n

= 6
-
8); 31
L
/31
L

(
n

= 7
-
9). *
-

p


0.05; **
-

p

0.01


по сравнению с физ. р
-
ром внут
ри каждого генотипа; ##
-

p

0.01


по сравнению с +
\
+ мышами на фоне введения физ. р
-
ра.

17






5.
БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕН
НОСТИ ГОЛОВНОГО МОЗГ
А
МЫШЕЙ ЛИНИИ 100
P
/100Р


Повышенная фармакологическая чувствительность

100Р/100Р

мышей в ответ
на
амфетамин


MANOVA

с повторными измерениями выявил достоверное влияние фа
к-
тора препарата [
F

(3,49) = 18.1;
p

< 0.001], генотипа [
F

(1,49) = 18.8;
p

0.001],
временного интервала [
F

(11,539) = 10.8;
p



0.001], препарат х временной и
н-
тервал [
F

(33,539) = 3.5;
p

< 0.001], генотип х временной интервал [
F

(11,539) =
3.5;
p

< 0.001] и генотип х препарат х временной интервал [
F

(33,539) = 1.8;
p


0.05] взаимодействий на пройденное расстояние в установке «отк
рытого поля».
Амфетамин в низкой дозе (0.5 мг/кг) достоверно повышал двигательную акти
в-
ность у 100Р/100Р мутантных мышей (Рис.
6
Б), не оказывая действия на да
н-
ный показатель у мышей дикого типа. Амфетамин в дозах 1 мг/кг и 2.5 мг/кг
оказывал стимулирующее
действие на двигательную активность животных
двух исследуемых генотипов (Рис.

,Г), хотя выраженность действия псих
о-
стимулянта в дозе 1 мг/кг на 100Р/100Р мышей сохранялась более высокой, чем
у контрольной линии.



Содержание моноаминов в
отделах головного мозга.
Уровень основных
моноаминов и их метаболитов в прилежащем ядре, стриатуме, гиппокампе и


Рис. 6.

Эффекты острого введения амфетамина (0.5 мг/кг; 1 мг/кг; 2.5 мг/кг) на дв
и-
гательную активность мышей дикого типа (+/+) и 100Р/100Р мутантов в тесте «О
т-
крытое поле». Амфетамин повышал моторную активность в дозо
-
зависимой мере у
мышей дикого типа (+/+;
n

= 7
-
10) и 100Р/100Р (
n

= 7
-
9) (
А
-
Г
), но только амфет
а-
мин в низкой дозе (0.5 мг/кг) вызывал гиперактивность у мутантных мышей
100Р/100Р (Б). *
-

p

0.05; **
-

p

0.01; ***
-

p

0.001


по сравнению с мышами
дикого типа (+/+).


18






Уровень межклеточного дофамина в стриатуме в ответ на введение
амфетамина в низкой дозе (0.5 мг/кг).
Рисунок
7
А
-
Б иллюстрирует эффекты
низкой
дозы амфетамина на выброс дофамина в межсинаптическую щель в
нейронах стриатума у мышей дикого типа и 100
P
/100
P

мутантов. Базовый ур
о-
вень дофамина не отличался у экспериментальных животных двух генотипов
(Рис
7
А;
p

� 0.05).
ANOVA

выявил достоверное влияние

временных интервалов
[
F

(16, 160) = 12.61;
p

< 0.001], но не генотипа [
F

(1,10) = 1.3;
p

> 0.05] или их
взаимодействий [
F

(16,160) = 0.25;
p

> 0.05]. После 30 минут уровень внекл
е-
точного дофамина составляло 270.1 ± 20.5% у мышей дикого типа и 290.2 ±
40.6

% у 100Р/100Р линии у мышей (Рис.
7
Б).




















Плотность высокочувствительных дофаминовых рецепторов
D
2
high

в
стриатуме
.

Для дальнейшего исследования дофаминовой системы у 100
P
/100Р

линии мышей была оценена плотность высокочувствительных дофаминовых
рецепторов
D
2
high

в гомогенате стриатума. На Рис.
8

показано конкурентное
связывание дофамина и [
3
H
]
-
домперидона к
D
2 рецепторам в гомогенате стри
а-
тума мышей дикого типа (+/+) и 100Р/100Р мутантных мышей. Неспецефич
е-
ское связывание определялось в присутствии 10 µМ сульпирида. Пропорция
D
2
рецепторов в высо
кочувствительном состоянии
D
2
high

составила в среднем 18 ±
1.4% в гомогенате стриатума +/+ мышей, в то время как данный показатель с
о-
ставил 38 ± 1.2% у 100Р/100Р мышей (
t
-
критерий =
-

10.95,
p

< 0.001). Пло
т-
ность дофаминовых рецепторов
D
2
high

повысилась на

113% у мутантных м
ы-
шей. Общее число замещаемого связывания, т.е. специфическое связывание,
определяемое содержанием 10 µМ сульпирида, 2 нм [
3
H
]
-
домперидона

было
874

± 62 (дезинтеграция за минуту/на фильтр) в лизате контрольных мышей,
что было принято за 1
00% специфического связывания. Данный показатель у
мутантных мышей составил 753±85 (дезинтеграция за минуту/на фильтр) (
p


0.05), что достоверно не отличалось от данного параметра у контрольных м
ы-
шей
.




Рис. 7.

Содержание внеклеточного дофамина как на базовом уровне (
А
), так
и после введения амфетамина (0.5 мг/кг) (
Б
) у мышей дикого типа (+/+) и
мутантов 100Р/100Р.

А

Б

19























Эффекты галоперидола (0.8 мг/кг) на гиперактивность, вызванной амф
е-
тамином.
Для оценки вклада
D
2 рецепторов в гиперактивность, вызванной
психостимуля
тором
, был проведен да
нный фармакологический эксперимент.
MANOVA

обнаружила достоверный эффект генотипа [
F

(1,61) = 25.7;
p

0.01],
фармакологических препаратов [
F

(3, 61) = 56.1;
p

< 0.001], временного инте
р-
вала [
F

(11, 671) = 12.6;
p



0.001], взаимодействий препарат х временной и
н-
тервал [
F

(33,671) = 5.8;
p

< 0.01] и генотип х препарат х временной интервал [
F

(33, 671) = 14.7;
p

< 0.01]. Введение амфетамина (0.5 мг/кг) вызывало гипера
к-
тивность у 100Р/100Р мутнатных мышей (Рис. 9), не о
казывая действия на м
ы-
шей дикого типа. Галоперидол эффективно блокировал эффекты амфетамина,
нормализуя двигательную активность 100Р/100Р мутантов.



Рис. 8.
Конкурентное связ
ы-
вание к
D
2 рецепторам
между
дофамином и [
3
H
]
-
домперидоном в лизатах стр
и-
атума мышей дикого типа
(+/+) и мутантов 100Р/100Р.
Пропорция
D
2 рецепторов в
высокочувствительном сост
о-
янии (
D
2
high
) в среднем явл
я-
лась 18 ± 1.4% в гомогенате
стриатума +/+ мышей, в то
время как данный пок
азатель
составил 38 ± 1.2% у
100Р/100Р мышей (
p

0.001).


Рис. 9.
Галоперидол (0.8
мг/кг) блокировал гипе
р-
активность у мышей
DISC
1
-
L
100
P

(100
P
/100
P
),
вызванную

амфетамином
(0.5 мг/кг) (
n

= 7
-
10). *
-

p

0.05; **
-

p

0.01; ***
-

p

0.001


по сравнению с
физ. раствором внутри
каждого генотипа; @
-

p


0.01


по сравнению с
100
P
/100Р

мутантными
мышами на фоне введения
амфетамина.


20







Межбелковые взаимодействия
Disc
1
-
L
100
P

с
PDE
4
B
,
GSK
-
3 и
D
2
R


N
-
конец
DISC
1 белка связывается с
UCR
2 доменом
PDE
4
B

в цАМФ
-
зависимой манере (
Millar


al
., 2005). Именно,
DISC
1 связывает нефосфорил
и-
рованный фермент
PDE
4
B

с пониженной активностью, который высвобождае
т-
ся в ответ на повышение уровня цАМФ и фофорилируется с помощью РКА.
Следовательно, взаимодействия
между
DISC
1

и
PDE
4
B

модулируются внутр
и-
клето
чным уровнем цАМФ. Оценка ферментативной активности
PDE
4
B

в лиз
а-
тах головного мозга экспериментальных мышей не выявила изменений у
100Р/100Р линии (Рис.
10
). В то время как взаимодействия
между
DISC
1

и
PDE
4
B

достоверно ослаблены у 100Р/100Р мышей.





























Поскольку
N
-
конец
DISC
1 протеина (участок между 1 и 220 а.к.) также
напрямую взаимодействует с
GSK
-
3β, подавляя ее активность и нарушая рег
у-
ляцию
Wnt
/
β
-
катенинового пути и пролифе
рацию нейрональных предшестве
н-
ников (
Mao


al
., 2009), на следующем этапе пр
едставлялось актуальным оц
е-
нить эффект
DISC
1
-
L
100
P

мутации на взаимодействие с
GSK
-
3. Применив м
е-
тод коиммуноперципитации, было обнаружено, что
DISC
1
-
L
100
P

достоверно
слабее взаимодействует с
GSK
-
3α и
GSK
-
3β в лизатах стриатума (
p

s



0.05),
снижая связывание с
GSK
-
3α,β на ~ 30% и 40%, соответс
т
венно (Рис.
11
А
-
В).



А

Б

В

Рис.
10
.
Ослабленное взаимодействие
между
DISC
1
-
L
100
P

и

PDE
4
B
.
А.
В
е-
стерн блоттинг
PDE
4
B
1 иммуноперцепитации с
DISC
1 (верхняя панель) и
PDE
4
B

(нижняя панель) антителами. Полоса
DISC
1 блота соответствуют 100
кДа и полоса
PDE
4
B

-

80 кДа.
Б.

Ассоциация между экзогенно экспрессиру
ю-
щимися
PDE
4
B

изоформами и мутантным
DISC
1 белком. Была проведена п
я-
тикратная оценка межбелковых связываний, используя антитела к
PDE
4
B
1
(В1) и
PDE
4
B
3 (В3). Числа в каждом столбике обозначают число независимых
экспериментов. Связывание
PDE
4
B

изоформ к
DISC
1
-
L
100
P

мутантной форме
протеина достоверно снижена (
p

s

< 0.001) по отношениию к контрольному
DISC
1 +/+.
В.

Ферментативная активность
PDE
4
B

достовер
но не отличалась
между 100Р/100Р и +/+ в лизатах головного мозга мышей (
n

= 4 и
n

= 4, соо
т-
ветственно). Активность представлена в виде среднего трёх независимых эк
с-
периментов. ***
-

p

0.001


по сравнению с мышами дикого типа (+/+).


21






Реципрокный анализ выявил, что обе изоформы
GSK
-
3α,β также достоверно
слабее взаимодействуют с
DISC
1
-
L
100
P

(
p

s

< 0.05), снижая связывание
c

DISC
1
-
L
100
P

на ~ 50% в обоих случ
аях (Рис
11
Г
-
Ж).































Рис. 10.
Ослабленное взаимодействие
между
DISC
1
-
L
100
P

с
GSK
-
3
α

и
GSK
-
3
β

в л
и-
затах стриатума мышей дикого типа (+/+;
n

= 5) и
DISC
1
-
L
100
P

(100
P
/100
P
;
n

= 5).
А.
Вестерн блоттинг
DISC
1 иммуноперцепитации с
DISC
1 (верхняя панель) и
GSK
-
3α и
GSK
-
3β (нижняя панель) антителами. Полоса
DISC
1 блота соответствуют 95 кДа, п
о-
лоса
GSK
-
3
α

-

50 кДа,
GSK
-



45 кДа.
Б
-
В.

Денситометрический анализ коимму
н
о-
персипитации
DISC
1 с
GSK
-
3α (
Б
) и
GSK
-
3β (
В
). Связывание
DISC
1
-
L
100
P

с
GSK
-
3
изоформами достоверно снижено (
p

s

< 0.05) по сравнению с +/+ мышами.
Г.

Вестерн
блоттинг
GSK
-
3β иммуноперцепитации с
DISC
1 (верхняя панель) и
GSK
-
3β (нижняя
панель) антителами.

Д
. Денситометрический анализ коиммуноперсипитации
GSK
-
3
β

с
DISC
1.
Е.
Вестерн блоттинг
GSK
-
3α иммуноперцепитации с
DISC
1 (верхняя панель) и
GSK
-
3α (нижняя панель) антителами.
Ж
. Денситометрический анализ коиммунопе
р-
сипитации
GSK
-
3α с
DISC
1. *
-

p



0.05


по сравнению с +/+ мышами.


А

Б

В

Г

Д

Е

Ж

22







Для оценки ферментативной активности
GSK
-
3 оценивали уровень фосф
о-
рилирования
GSK
-
3α и
GSK
-
3β также в лизатах стриатума экспериментальных
животных. Оказалось, что количество фосфорилированной формы
GSK
-


в
позиции Серин
-
21 достоверно снижено у 100Р/100Р мутантов по сравнению с
мышами дикого типа (
p

< 0.01; Рис. 24А
-
Б), в то время как фосфорилирование
GSK
-
3β достоверно не отличалось между генотипами. Также не было найдено
межгенетич
е
ских отличий по уровню
общей экспрессии
GSK
-

\
β (Рис. 24А
-
Б).




















Учитывая, нарушения взаимо
действия между

DISC
1
и

GSK
-
3
, вызванны
е

DISC
1
-
L
100
P

мутацией на фоне проявления шизофреноподобного поведения у
мышей линии 100
P
/100Р

и их чувствительности к антипсихотикам, а также тот
факт, что активация
D
2

рецепторов (
D
2
R
), яв
ляющихся основной терапевтич
е-
ской мишенью антипсихотиков,
стимулирует
GSK
-
3 внутриклеточный си
г-
нальный путь
,

следующим этапом исследования была оценка
взаимодействий

между
DISC
1 и
D
2

рецепторами
.

Коиммунопреципитационный

анализ выявил
достоверное усиление взаимодействий между
D
2

рецепторами

и
DISC
1 (Рис.
1

-
Б;
p

< 0.01) без изменений уровня экспрессии
D
2

рецепторов

у 100Р/100Р
мутантных мышей (Рис.
1
2
Б
).






Рис. 11.
Функциональная активность
GSK
-
3 в лизатах стриатума мышей дик
о-
го типа (+/+;
n

= 7) и 100Р/100Р (
n

= 15).
А
. Репрезентативный вестерн бло
т-
тинг иммуноперципитации

с антителами к
pGSK
-
3
α
\
β

по Серину
-
21/9, общей
экспрессии
GSK
-
3
α
\
β

протеина, а также
GAPDH

в качестве контроля загрузки
образцов.
Б
. Денситометрический анализ иммунопер
ц
ипитации с использу
е-
мыми антителами. **
-

p

0.01


по сравнению с +/+ мышами.


А

Б

23


























Эффекты фармакологического и генетического ингибирования
GSK
-
3 на деф
и-
цит престимульного торможения у 100Р/100Р линии мышей.

Принимая во внимание повышенную ферментативную активность
GSK
-
3
(Рис.
11
А
-
Б) у мышей линии 100Р/100Р, представлялось актуальным оценить
эффективность блокатора
GSK
-
3 в коррекции шизофреноподобного поведения
у мышей данной линии. Для достижения данной цели
использовали фармак
о-
логический ингибитор
GSK
-
3


TDZD
-
8, а также нокаутных мышей по гену
GSK
-
3α.

Введение
TDZD
-
8 (фармакологический блокатор
GSK
-
3) в дозе 7.5 мг/кг
скорректировало нарушения когнитивных функций у экспериментальных
животных. Так,
MANOVA

вы
явил достоверное влияние престимулов [
F

(2,90) =
33.2;
p

< 0.01], генотипа [
F

(1, 45) = 64.2;
p

< 0.001], препарата [
F

(2,45) = 41.5;
p

< 0.001], а также взаимодействий генотип х препарат [
F

(1,45) = 31.8;
p

0.001]
на пре
-
стимульное торможение.
TDZD
-
8 до
стоверно корректировал дефицит
пре
-
стимульного торможения у 100Р/100Р мышей (Рис.
13
А), не оказывая
действия на акустическую реакцию вздрагивания.


Параллельно с фармакологическим ингибированием активности
GSK
-
3,
также оценивался эффект генетической инактивации
GSK
-
3α у мышей,
несущих аллели дикого (+/+) или мутантного (100Р/100Р) типа при создании
двойных мутантов (100
P
/100Р

x

GSK

-
KO
).
MANOVA

выявил достоверное
влияние престимулов [
F

(2,134) = 24.2;
p

0.00
1] и генотипа [
F

(5,67) = 27.5;
p


0.001] на престимульное торможение реакции вздрагивания. Дефицит
сенсорно
-
моторной фильтрации у 100
P
/
+

и
100Р/100Р
мышей восстанавливался
при генетическом снижении экспрессии
GSK
-
3α ал
л
еля на 50% (Рис.
13Б
).
Также был об
наружен достоверный эффект генотипа [
F

(5,67) = 19.4;
p

0.001]


Рис.
1
2.
Усиление взаимодействий между
DISC
1
-
L
100
P

протеином

и
D
2

р
е-
цепторами

в лизатах стриатума мышей дикого типа (+/+;
n

= 5) и
DISC
1
-
L
100
P

(100
P
/100
P
;
n

= 6).
А.
Вестерн блоттинг
D
2
R

иммуноперцепитации с
DISC
1 (верхняя панель) и
D
2
R

(нижняя панель) антителами. Полоса
DISC
1
блота соответствуют 100 кДа, полоса
D
2
R

-

50 кДа.
Б
-
В.

Денситометрический
анализ коиммуноперсипитации
D
2
R

с
DISC
1 (
Б
) и
уровня экспрессии
D
2
R

(
В
). *
*

-

p

0.0
1



по сравнению с +/+ мышами.


А

Б

В

24






на амплитуду реакции вздрагивания, но подобно эксперименту с
TDZD
-
8,
отсутствие ал
л
еля
GSK
-
3α не изменило реакцию вздрагивания у
гетерозиготных и гомозиготных
DISC
1
-
L
100Р мышей
.






























Эффекты коррекции усиленных взаимодействий
между
DISC
1
и

D
2

р
е-
цепторами

с помощью
TAT
-
D
2
R

пептида на шизофреноподобное поведение
100Р/100Р мышей.

На основе выявленного усиления взаимодействий между
DISC
1
-
L
100Р и
D
2

рецепторов

в

дальнейшем рядом биохимических экспериментов было ка
р-
тировано место взаимодейст
в
ия
D
2 рецептора с
DISC
1 протеином (район трет
ь-
ей внутриклеточной петли
D
2

рецептора

[
K
211
-
T
225
]). В свою очередь,
N
-
конец
DISC
1, но не С
-
конец, взаимодейств
ует
с
D
2

рецепторами

(
Su


al
.,
2014). Следовательно, был синтезирован пептид, размыкающий
взаимодействия

между
DISC
1

и

D
2

рецепторами

(ТАТ
-
D
2
R
)
для

коррек
ции
DISC
1

x

D
2
R

ме
ж-
белкового ком
плекса

и связанного

с ним
GSK
-
3 фосфорилировани
я
, оказывая
антипсихотическое действие на экспериментальных животных. Для проверки
данного предположения оценивали эффективность ТАТ
-
D
2
R

пептида (3
нмоль/г) введенного внутрибрюшинно за 30 минут до тестирования.
MAN
OVA

выявил достоверный эффект генотипа [
F

(1,49) = 6.35;
p

< 0.05], пептида [
F



Рис.
13
.

Эффекты фармакологического (
А
) и генетического (
Б
) ингибиров
а-
ния
GSK
-
3

на дефицит престимульного торможения у 100Р/100Р линии м
ы-
шей.
А
.

TDZD
-
8 в дозе 7.5 мг/кг корректировал дефицит сенсорно
-
моторной
фильтрации у
100Р/100Р мышей

(
N

= 7
-
12 мышей). #
-

p

0.001


по сравн
е-
нию с +/+ мышами на фоне введения физ. раствора; ***
-

p

0.001


по
сравнению с 100Р/100Р мышами на фоне введения физ. р
-
ра.

Б
.

Эффекты г
е-
нетической инактивации
GSK
-
3
α

на дефицит сенсорно
-
моторной фильтр
а-
ции информации у 100
P
/
+

и
100Р/100Р
мышей. Процент престимульного
торможения реакции вздрагивания у генетических кроссов между 100
P
/100Р

и
GSK
-
3
α

гетерозиготными мышами. #
-

p

0.01, ##
-

p

0.001


по сравн
е-
нию с
DI
SC
1
-
L
100
P

мышами; **
-

p

0.01; ***
-

p

0.001


по сравнению с
+/+ мышами.

А

Б

25






(1,49) = 18.9;
p

< 0.001], временного интервала [
F

(5, 245) = 63.1;
p

< 0.001] и их
взаимодействий (
p

s

0.05
-
0.001) на двигательную активность. 100Р/100Р м
ы-
ши на фоне введения

контрольных соединений проявили гиперактивность по
сравнению с мышами дикого типа (Рис.
14
А), однако введение ТАТ
-
D
2
R

пе
п-
тида корректировало их гиперактивность, не оказывая седативного действия на
мышей дикого типа. Аналогичное действие ТАТ
-
D
2
R

пептида на
блюдалось на
дефицит престимульного торможения у 100Р/100Р мутантных мышей.
MANOVA

обнаружил существенное влияние генотипа [
F

(1,42) = 21.9;
p


0.001], пептида [
F

(1,42) = 40.3;
p

< 0.001], пре
-
стимулов [
F

(3,126) = 24.6;
p



0.001] и генотип х пептид взаимодействий [
F

(2,42) = 22.3;
p

< 0.001] на пр
е-
стимульное торможение реакции вздрагивания. 100Р/100Р мутанты продемо
н-
стрировали дефицит пре
-
стимульного торможения при введении физиологич
е-
ского раствора и контрольного соединени
я, но введение ТАТ
-
D
2
R

пептида
нормализовало их дефицит сенсорно
-
моторной фильтрации (Рис.
14
Б), не ок
а-
зывая действия на амплиту
ду вздрагивания мышей
.


























Таким образом, исследование биохимических особенностей головного
мозга 100Р/100Р мутантных мышей идентифицировало повышенную функци
о-
нальность дофаминергической системы, вызванной, во
-
первых, нарушением
взаимодействий
между
DISC
1
-
L
100
P

и

D
2 рецепторами, а также
PDE
4
B

и
GSK
-
3, что в свою очередь также повышало ферментативную активность
GSK
-
3. Во
-


Рис. 14.

Эффект ТАТ
-
D
2
R
-
пептида на пройденное расстояние за 30
минут (
А
), а
также на престимульное торможение (
Б
) реакции вздрагивания у мышей дикого
типа (+/+;
n

= 8
-
8 и
n

= 8
-
8) и 100Р/100Р (
n

= 9
-
16 и
n

= 8
-
8). #
-

p

0.05; #
-

p


0.001


по сравнению с +/+ мышами на фоне введения физиологического ра
с-
твора и ТАТ
-
D
2
R
-
контрольного соединения; *
-

p

0.05; **
-

p

0.01; ***
-

p


0.001


по сравнению с физиологическим раствором и ТАТ
-
D
2
R
-
контрольным
соединением внутри каждого генотипа.


А

Б

26






вторых, обнаружено повышенное количество
D
2

рецепторов

в высокочувств
и-
тельном состоянии в стриатуме 100Р/100Р мутантов, отражающее, по
-
видимому, последствия нарушения работы
DISC
1 ин
терактома, и являющейся
одной из причин повышенной фармакологической чувствительности к амфет
а-
мину у мышей данной генетической линии. Примечательно, что существенных
изменений уровня дофамина и его метаболитов как на базовом уровне, так и
под воздействием
психостимулянта, не выявлено. В
-
третьих, обнаружено, что
блокаторы
PDE
4
B

и
GSK
-
3, а также ТАТ
-
D
2
R
-
пептид оказывают антипсихот
и-
ческие эффекты, корректируя шизофреноподобное поведение 100Р/100Р м
ы-
шей. Показан синергистический эффект
in

vivo

между
фармакологи
ческими
блокаторами
PDE
4
B

и
GSK
-
3 на 100Р/100Р мутантах, демонстрируя их со
в-
местную внутриклеточную функциональность в ассоциации с
DISC
1.

6.

Патогенное взаимодействие между
генетической предрасположенн
о-
стью к шизофреноподобному поведению (
100
P
/
+
)
и материнской иммунной
активацией (МИА):
г
ибридная
(ген х среда)

модель шизофрении

Шизофрения является болезнью нейроразвития, где
DISC
1 и его интера
к-
том выполняют важную роль, оказывая влияние на пролиферацию клеток
-
предшественников, их миграцию, и диффе
ренцировку (
Chubb


al
.,

2008;
Bra
n-
don

and

Sawa
, 2011). Следовательно, было предположено, что поскольку
100Р/100Р мутация вызывает шизофреноподобное поведение у мышей, то во
з-
действие материнской иммунной активаци
ей

(МИА) в эмбриогенезе на мышей
с предрасп
оложенностью к шизофрении, т.е. на 100Р/
+

гетерозиготных мышей,
нарушит

их

нейроразвитие и спровоцирует шизофреноподобное поведение.

На первом этапе данного исследования оценивали эффект МИА, вызва
н-
ной
PolyI
:
C

в дозе 5 мг/кг согласно литературе (
Meyer


al
., 2005) на поведение
+/+, 100
P
/
+

и 31
L
/
+

мышей.
MANOVA

выявил достоверный эффект МИА [
F

(1,24) = 36;
p

< 0.001], генотипа [
F

(2,24) = 21;
p

< 0.001] и их взаимодействий [
F

(2,24) = 21;
p

< 0.001] на число помётов, а также на число потомков: эффект
МИА [
F

(1,24) = 27.9;
p

< 0.001], генотипа [
F

(2,24) = 19.9;
p

< 0.001], эффект
генотип х МИА взаимодействий [
F

(2, 24) = 19,7;
p



0.001]. Самки 100Р/+ под
воздействием МИА в дозе 5 мг/кг не имели потомства, хотя данные показатели
не отличались у остальных экспериментальных групп, включая 31
L
\
+ линию.
Следовательно, в последующих экспериментах использовали
PolyI
:
C

в дозе 2.5
мг/кг.


Пре
-
стимульное торможение:
MANOVA

обнаружил существенное вл
и-
яние МИА [
F

(1,48) = 5.3;
p

< 0.05], пре
-
стимула [
F

(2,96) = 86.4;
p

< 0.001], г
е-
нотип х МИА [
F

(1,48) = 4.7;
p

< 0.05] и МИА х пре
-
стимул [
F

(2,96) = 5.4;
p


0.01] взаимодействий на пре
-
стимульн
ое торможение.
PolyI
:
C

не влиял на пр
е-
стимульное торможение у мышей дикого типа (Рис. 15А), в то время как выз
ы-
вал дефицит престимульного торможения у 100Р/+ мышей.
MANOVA

также
выявил эффект генотипа [
F

(1,48) = 10.7;
p

< 0.01] на амплиту
д
у вздрагивания,
но не МИА и их взаимод
ействий
.

Социальная мотивация и распознавание:

MANOVA

обнаружил достове
р-
ный эффект МИА [
F

(1,44) = 8.2;
p

< 0.01], «партнёра 1» [
F

(1,44) = 142.9;
p


0.001], МИА х «партнёр 1» взаимодействий [
F

(1,44) = 10.6;
p

< 0.01] на соц
и-
27






альную мотивацию. Мыши двух генотипов под влиянием контрольного раств
о-
рителя (Р
BS
) демонстрировали интерес к «партнёру 1», проводя дольше врем
е-
ни возле «социального» отсека, чем у нейтрального (Рис.
15
Б
). МИА не оказ
ы-
вала влияния на социальную мотивац
и
ю у
мышей дикого типа, но нарушала
социальное поведение у гетерозиготных 100Р/
+

животных (
p

> 0.05), которые
проводили равное количество времени возле отсеков двух типов.



















Уровень интерлейкина
-
6
в головном мозге эмбрионов 100
Р/
+

х МИА мышей

Поскольку одним из ключевых цитокинов, вовлечённых в этиологию ш
и-
зофреноподобного поведения у мышей, вызванной
polyI
:
C
, является интерле
й-
кин
-
6 (ИЛ
-
6) (
Smith


al
.,

2007), то на следующем этапе данного исследов
ания
оценивали концентрацию ИЛ
-
6 в головном мозге эмбрионов мышей экспер
и-
ментальных групп.
MANOVA

выявил достоверный эффект генотипа [
F

(1, 39) =
113.5;
p

< 0.001], МИА [
F

(2, 39) = 357.0;
p

< 0.001] и их взаимодействия [
F

(2.39) = 95.5;
p

< 0.001] на уров
ень ИЛ
-
6. Оказалось, что
polyI
:
C

повышал ур
о-
вень ИЛ
-
6 в дозо
-
зависимой манере у мышей всех генотипов. Однако, эмбри
о-
ны 100Р/+ оказались более чувствительны к МИА в низкой дозе, чем эмбрионы
+/+ (
p

s

< 0.001) (Табл. 1).




Рис. 15.

Эффекты МИА, вызванной введением
polyI
:
C

(2.5 мг/кг) на пр
е-
стимульное торможение (
А
) у мышей дикого типа (+/+) и 100Р/
+

гетероз
и-
готных мышей.
N

= 7
-

16; *
-

p

0.05; **
-

p

0.01


по сравнению с
PBS
-
100Р/+ мышами. #
-

p

≤ 0.05


по сравнению с
PBS
-
+/+ мышами.
Б
) Эффе
к-
ты МИА

на социальную мот
ивацию у мышей дикого типа (+/+) и 100Р/
+

г
е-
терозиготных мышей.
N

= 8
-
12; *
-

p

0.05; **
-

p

0.01


по сравнению со
временем, проведенном возле пустого отсека внутри каждой группы. #
-

p


0.01


по сравнению с
PBS
-
+/+ мышами.


А

Б

28






Таблица
1
. Эффект МИА, вызванной
polyI
:
C

в двух дозах на уровень ИЛ
-
6 в
головном мозге эмбрионов мышей дикого типа (+/+) и 100
P
/100Р мутантных
мышей.

Экспериментальная

группа

PBS,

пг/мкг протеина

PolyI
:
C
-
2.5
мг/кг,

пг/мкг протеина

PolyI
:
C
-
5.0
мг/кг,

пг/мкг протеина

+/+

22
.
5 ± 11
.5

86.8
±

25.4

*

168.6
±

17.7

***

100Р/+

20.5
±

6.8

315.7
±

31.5

***

923.5
±

30.6

***

*
p

0.05; ***
-

p

0.001


по сравнению с
PBS

эмбрионами внутри ка
ж-
дого генотипа.
N

= 8 /на группу


Превентивный эффект антител к интерлейкину
-
6 на проявление шизофрен
о-
подобных эндофенотипов у 100
Р/
+
х МИА мышей


Повышенный уровень ИЛ
-
6 у 100Р/+ эмбрионов
в ответ на МИА

предп
о-
лагает, что, возможно, данный цитокин вовлечен в патогенез шизофреноподо
б-
ного поведения у гибридов 100Р/
+

х МИА. Для проверки данного предполож
е-
ни
я оценивали эффективность антител к ИЛ
-
6 предотвратить дефицит прест
и-
мульного торможения у 100Р/
+

мышей, вызванное МИА.

Престимульное торможение:

MANOVA

определил существенный э
ф-
фект престимулов [
F

(2,78) = 18.4;
p

< 0.001], генотипа [
F

(1,39) = 15.0;
p



0.001], МИА + антитела к ИЛ
-
6 [
F

(2,39) = 4.3;
p

< 0.05] и генотипа х МИА +
антитела к ИЛ
-
6 [
F

(2,39) =5.5;
p

< 0.01]. Потомки, рожденные от 100Р/
+

самок
после введения им
polyI
:
C
, продемонстрировали дефицит престимульного то
р-
можения в ответ на три
престимула по сравнению с контрольной группой (
p

s


0.01 при 69 дБ и 73 дБ и
p

< 0.05 при 81 дБ) (Рис.
16
А). Совместное введение
polyI
:
C

с антителами к ИЛ
-
6 предотвратило развитие дефицита престимульного
торможения у 100Р/
+

мышей (Рис.
1
6А).
MANOVA

обнару
жил достоверный
эффект генотипа [
F

(1,39) = 4.5;
p

< 0.01] и генотип х МИА взаимодействий [
F

(2,39) = 5.9;
p

< 0.01] на амплитуду вздрагивания. Введение совместно
polyI
:
C

с
антителами к ИЛ
-
6 повысило интенсивность вздрагивания, хоть и не достове
р-
но (
p

= 0.
08).

Латентное торможение
: Мыши всех экспериментальных групп не о
т-
личались по периоду А (
p

s

> 0.05; среднее значение периода А = 8.1 сек.).
MANOVA

обнаружил достоверное влияние пре
-
экспозиции [
F

(1,86) = 30.3;
p


0.001], генотипа [
F

(1,86) = 13.1;
p

0
.001], генотип х МИА+антитела к ИЛ
-
6 [
F

(2,86) = 10.1;
p

< 0.001], пре
-
экспозиция х МИА + антитела к ИЛ
-
6 [
F

(2,86) =
8.2;
p

< 0.001] взаимодействия на латентное торможение. Мыши +/+ от
PBS
-
самок продемонстрировали латентное торможение (
p



0.001), в то время как у
Р
olyI
:
C
-
100Р/
+

мышей наблюдалось нарушение латентного торможения (
p


0.05), однако введение антител к ИЛ
-
6 совместно с
PolyI
:
C

не вызывало нар
у-
шения данного типа поведения (Рис.
1
6
Б
).




29






Данное исследование, во
-
первых, продемонстрировало специфичность и


Рис.
17
.

Совместное введение антител к ИЛ
-
6 (анти
-
ИЛ
-
6) с
PolyI
:
C

(2.5 мг/кг)
предотвращало дефицит престимульного торможения
(А)

и латентного торм
о-
жения
(Б)

у 100Р/
+

гетерозиготных мышей.
А
. 100Р/
+

мыши, рожденные от м
а-
терей имевших иммунную активацию, вызванную
PolyI
:
C
, продемонстриров
а-
ли дефицит престимульного торможения. Введение анти
-
ИЛ
-
6 совместно с
Po
l-
yI
:
C

нормализовало дефицит престимульного торможения и амплитуду вздр
а-
гивания.
N

= 8
-
9, *
-

p

0.05; **
-

p

0.01


по сравнению с
PBS

группой вну
т-
ри 100Р/+;

#
-

p

0.05; ##
-

p

0.01; ###
-

p

0.001


по сравнению с
PBS

гру
п-
пой внутри +/+ группы.
Б
. Коэффициент подавления питья у экспериментал
ь-
ных животных с пре
-
экспозицией к тону (ПЭ) и без пре
-
экспозиции к тону
(БПЭ) при обучении с 2 парами тон
-
шок и 40
пре
-
кспозициям к тону.
N

= 6
-
9;
**
-

p

0.01; ***
-

p

0.001


по сравнению с ПЭ группой внутри каждой эк
с-
периментальной группы.


А

Б

30






патогенность точечной мутации
DISC
1
-
L
100Р, имеющей отношение к
психопатологическим процессам шизофреноподобного состояния.
Действительно, введение
PolyI
:
C

в дозе 5 мг/кг оказывало сходный эффект на
мышей дикого типа +/+ и на 31
L
/
+

линию мышей, в то время как материнская
им
м
унная активация, вы
званная пониженной дозой
PolyI
:
C
, провоцировала
шизофреноподобное поведение только у 100Р/
+

гетерозиготных животных, не
оказывая действия на мышей дикого типа

(
Lipina


al
., 2013)
. Гетерозиготные
животные с 100Р/
+

мутацией проявили предрасположенность к
ш
изофреноподобному поведению, поскольку материнская им
м
унная активация
(МИА) спровоцировала у них развитие данного типа психопатологии. Во
-
вторых, полученные данные доказали роль
DISC
1
-
L
100
P

в процессах
нейроразвития, учитывая воздействие МИА на ранней стад
ии эмбриогенеза. В
-
третьих, показано, что МИА посредством провоспалительного цитокина ИЛ
-
6
опосредует шизофреноподобное поведение у 100P/
+
гетерозиготных мышей.
Наконец, комбинация 100Р/
+

с МИА у мышей представляет собой новую
гибридную модель шизофрении,
сочетая два этиологических фактора данного
заболевания, и в большей степени соответствуя ситуации в человеческой
популяции, поскольку генетические, этиологические и нейробиологические
исследования доказали, что шизофрения является результатом совместного
д
ействия патогенной генетической мутации(й) с факторами окружающей среды
(
O
'
Tuathaigh


al
.,

2015;
van

Os


al
.,

2010
). Следовательно, последующие
исследования на данной гибридной модели откроют новые нейробиологические
механизмы, особенно, касающиеся нейроглиальных взаимодействий в процессе
нейроразвития шизофреноподобного поведения.


7.

П
оиск и валидация новых мишен
ей для создания превентивной тер
а-
пии: молекулярно
-
клеточный анализ эффектов вальпроата на шизофр
е-
ноподобные эндофенотипы 100
P
/100Р

мышей

Шизофрения является болезнью нейроразвития (
Lewis

and

Lewitt
, 2002),
где первые симптомы заболевания отмечают в подрост
ковый период. В наст
о-
ящее время особо актуальным является исследование молекулярно
-
клеточных
механизмов развития патологических процессов шизофрении с целью ее ранней
диагностики и превенции. Предыдущее исследование, используя 100Р/
+

х МИА
модель, косвенно

продемонст
р
ировало вовлечение
DISC
1
-
L
100
P

в процессы
нейроразвития, а также многочисленные
независимые
результаты доказали
непосредственный вклад
DISC
1 в процессы пролиф
е
рации, миграции, интегр
а-
ции нейронов (
Mao


al
.,

2009;
Singh


al
.,

2010;
Kamiya


al
.,

2005;
Kubo


al
.,

2010;
Young
-
Pearse


al
.,

2010). Следовательно, на следующем этапе иссл
е
д
о-
вания представлялось актуальным оценить 1)

проявление шизофреноподобного
поведения у 100Р/100Р мутантных мышей в процессе нейроразвития; 2)

во
з-
можность пред
отвращения данной психопатологии многофункциональным
препаратом, вальпроатом, 3)

выявить новую молекулярную мишень, вовлече
н-
ную в процессы формирования шизофреноподобного поведения с чувствител
ь-
ностью к превентивной терапии.


31






Проявление шизофреноподобных э
ндофенотипов у 100
P
/100Р

мышей в во
з-
расте 16 недель, но не 8 недель



Поведение 100Р/100Р мутантных мышей оценивали в подростковый п
е-
риод, в возрасте 8 недель, когда уже созревает функциональность
отделов г
о-
ловного мозга, регулирующих процессы
престимульно
го
торможения и латен
т-
ного торможения (
Willott


al
.,

2003;
Zheng


al
.,

1999;
Zuckerman


al
.,

2003), а
также во взрослом состоянии, в возрасте 12 недель.

Двигательная активность
:
MANOVA

выявил эффект генотипа [
F

(1,22) = 4.5;
p

< 0.05], возраста [
F

(
1,22) = 17.1;
p

< 0.001] и их взаимодействия [
F

(1,22) =
9.4;
p

< 0.01] на пройденное расстояние. 100Р/100Р мутанты проявляли гипе
р-
активность в возрасте 12 недель, но не 8 недель (Рис. 18А).

Престимульное торможение акустической реакции вздрагивания
:
MANOVA

обнаружил
достоверное влияние престимулов [
F

(2,98) = 150.2;
p

< 0.001], ген
о-
типа [
F

(1,49) = 58.8;
p

< 0.001], возраста [
F

(1,49) = 4.97;
p

≤ 0.05], и генотип х
возраст взаимодействий [
F

(1,49) = 9.3;
p

< 0.01] на престимульное торможение.
Дефицит престимульного то
рможения был существенне выражен у 100Р/100Р
мышей в возрасте 12 недель по сравнению с 8
-
нельным возрастом (Рис.
18
Б
).
MANOVA

обнаружил достоверный эффект генотипа [
F

(1,49) = 19.9;
p

0.001],
и генотип х возраст взаимодействий [
F

(1,49) = 8.6;
p



0.01] на амплитуда ак
у-
стической реакции вздрагивания. Интенсивность реакции вздрагивания у
100Р/100Р мутантов в возрасте 8 недель не отличалась от данного показателя у
+/+ мышей, но достоверно снижалась у 12
-
недельных мышей (
p

0.001).



Рис. 18.
100Р/100Р мутантные мыши проявляют шизофреноподобное поведение
в возрасте 12 недель, но не в 8 недель.
А
. 12
-
недельные 100Р/100Р мыши прод
е-
монстрировали гиперактивность по сравнению с мышами дикого типа (+/+) (
N

=
7
-
19);
Б
. 12
-
недельные 100Р/100Р мутанты п
роявили дефицит престимульного
торможения (
N

= 7
-
10); *
-

p

0.05; **
-

p

0.01; ***
-

p

0.001


по сравнению
с мышами дикого типа внутри каждой возрастной группы.

А

Б

32






Превентивная эффе
ктивность вальпроата на шизофреноподобные эндофен
о-
типы у
100Р/100Р

мышей

Следующим этапом исследовани
я

была оценка превентивной эффекти
в-
ности хронического введения вальпроата (200 мг/кг) экспериментальным ж
и-
вотным в возрасте с 10 по 12 неделю с последующей

оценкой шизофреноп
о-
добного поведения у 100Р/100Р мышей в возрасте 12 и 15 недель. В качестве
превентивного средства вальпроат был выбран по нескольким причинам.
Во
-
первых,

использование антипсихотиков в качестве превентивной медицины я
в-
ляется ограниченным

(
Marshall

and

Rathbone
, 2011).

Во
-
вторы
х, вальпроат уже
одобрен для применения подростками
для
превенции психоза
(
Lambert


al
.,
2016
)
.

В
-
третьих
, поскольку шизофрению вызывают множественные факторы,
то подходящим превентивным соединением

окажется такое
средство, которое
воздействует на несколько механизмов действия (
Buchanan


al
., 2009)
, каким
является в
альпроат (
Phiel


al
., 2001;
Williams


al
., 2002;
Kim


al
., 2007;
Monti


al
., 2009
;
Chateauvieux


al
., 2010).


Оказалось, что 2х
-
недельное введение вальпроат
а корректировало гипе
р-
активность и дефицит престимульного торможения у 100Р/100Р мышей в во
з-
расте 12 недель (Рис.
19
А). Примечательно, что эффект вальпроата на оценив
а-
емое поведение сохранялся спустя 3 недели после отмены введения препарата,
т.е. в возраст
е 15 недель

(Рис. 19Б)
.

М
ANOVA

обнаружил влияние престимулов
[
F

(2,82) = 4.4;
p

<0.05], генотипа [
F

(1,41) = 7.6;
p

< 0.01], препарата [
F

(1,41) =
5.5;
p

< 0.05], и генотип х препарат взаимодействия [
F

(1,82) = 9.6;
p

< 0.01] на
престимульное торможение.
Вальпроат оказывал терапевтическое действие на
дефицит престимульного торможения у 100Р/100Р мутантных мышей (Рис.
19А
).








Рис. 19.
Хроническое введение вальпроата

экспериментальным мышам в во
з-
расте 10
-
12 недель предотвращало дефицит престимульного торможения (
А)
у 100Р/100Р мышей

и данный эффект сохранялся спустя 3 недели после пр
е-
кращения его введения (
Б
). (
N

= 16
-
19), #
-

p

0.05; ##
-

p

0.01


по сравн
е-
нию с мышами дикого типа (+/+) на фоне введения физиологического раств
о-
ра; *
-

p

0.05; **
-

p

0.01


по сравнению с 100Р/100Р на фоне введения
физиологического раствора.


А

Б

33






И
дентификация липокалина
-
2 (
Lcn
2) как гена
-
кандидата для ранней диагн
о-
стики и создания превентивной терапии



Транскриптомный
анализ выявил, что
DISC
1
Rgsc
1390

мутация имела
наиболее выраженный эффект на экспрессию генов в гиппокампе (61 ген), 13
генов изменили экспрессию в стволе головного мозга и не было обнаружено
изменений генетической экспрессии в стриатуме и коре головного
мозга. Анн
о-
тация функций генов гиппокампа выявила, что большинство из них вовлечены
в пролифирацию клеток (23%) и цитоскелет/форму клетки (15%). Вальпроат
значительно изменял экспрессию 3 генов в гиппокампе (
Hist
1
h
1
c
,
Hist
1
h
2
be
,
Clcn
2
) и 2 генов в стриатум
е (
Egr
2,
Fosb
). Среди 61 генов, изменивших свою
экспрессию под влиянием
DISC
1
Rgsc
1390

мутации
,

вальпроат скорректировал
экспрессию 13 генов (21.3%) в гиппокампе и
Lcn
2

в стволе головного мозга.
Экспрессия 14 генов изменилась только у 100Р/100Р на фоне действия вальпр
о-
ата
.


Выявленные изменения уровня мРНК для генов, которые меняли свою
экспрессию под влиянием: 1)

DISC
1
Rgsc
1390

мутации и вальпроата (ген х преп
а-
рат
взаимодействия) (
Arc
,
Purb
,
Egr
2,
Dusp
1,
Slc
40
a
1,
Mrpl
39,
Igf
1
); 2) только
100Р/100Р мутации (
Slc
6
a
12,
Adar
,
Lcn
2,
Ei
4
ebp
2
); 3) генотип х препарат вза
и-
модействия (
Cyr
61
), подтверждали с помощью детекции ПЦР продукта в реж
и-
ме реального времени (
qRT
-
PCR
).

Ко
рреляционный анализ данных, получе
н-
ных транскриптомным анализом (микроэррей) и
qRT
-
PCR

подтвердил дост
о-
верное изменение экспрессии 7 генов из 12 исследуемых


Lcn
2,
Egr
2,
Slc
40
a
1,
Arc
,
Dusp
1,
Cyr
61,
Slc
6
a
12
, где коэффициент корреляции составил
r

= 0.6;
p

=
0.037. На основе транскриптомного анализа и первичной валидации с помощью
qRT
-
PCR

наилучшим геном
-
кандидатом оказался ген
Lcn
2

(Рис.
20
А
). Втори
ч-
ная валидация
Lcn
2 подтвердила изменения его экспрессии на уровне протеина,
соответствующие
изменениям на ур
овне гена
(Рис.
20Б
-
В
). В частности,
наблюдалс
я

повышенн
ый

уровень

Lcn
2 в стволе головного мозга у 100Р/100Р
мутантов, существенно корректируемая вальпроатом.







А

Б

В

34






Взаимосвязь между экспрессией
Lcn
2, к
о
личеством глиальных клеток в обл
а-
сти рострального миграционного тракта и проявлением шизофреноподобных
энд
о
фенотипов у 10
0Р/100Р

мышей


Учитывая, что
DISC
1 (
Enomoto


al
.,

2009;
Mao


al
.,

2009;
Kim


al
.,

2009)
и
L
cn
2 (
Rodvold


al
.,

2012) вовлечены в клеточную пролифирацию

и поскол
ь-
ку наибольшую часть генов с изменённой экспрессией составляли гены, также
вовлечённые в пролифирацию (23%), на следующем этапе исследовали клето
ч-
ную пролиферацию у экспериментальных животных, используя маркер
ki
67
.
























Б

А


А

Рис. 20.

А.

Уровень
Lcn
2

мРНК, оцениваемый с помощью
qRT
-
PCR

(
N

= 5
-
6)
при нормализации на
Gapdh

и
β
-
актин
.
MANOVA

выявил эффект генотипа [
F

(1,15) = 18.4,
p

< 0.001], препарата [
F

(1,15) = 20.6;
p

< 0.001], и генотип х преп
а-
рат взаимодействий [
F

(1,15) = 18.2;
p

< 0.001] на уровень экспрессии
Lcn
2

мРНК.
Б
. Эксп
рессия
Lcn
2 протеина, оцениваемая с помощью вестерн блотти
н-
га, используя антитела к
Lcn
2 и β
-
актин (контроль) в лизатах ствола головного
мозга у экспериментальных животных (
N

= 6
-
7).
В
. Денситметрический анализ
количественной оценки интенсивности
Lcn
2 имму
нореактивных полос по отн
о-
шению к β
-
актину.
MANOVA

обнаружил эффект генотипа [
F

(1,20) = 31,4;
p


0.001], препарата [
F

(1,20) = 21.9;
p

< 0.001] и их взаимодействий [
F

(1,20) = 25.9;
p

< 0.001] на уровень
Lcn
2 протеина. *
-

р < 0.05


по сравнению с +/+ м
ышами
на фоне введения физ. раствора; #
-

p

0.05


по сравнению с 100Р/100Р мута
н-
тами на фоне введения физ. раствора.


35






Для идентификации типов пролиферирующих клеток были использованы
селективные маркеры для нейронов


антитела для
NeuN

(
neuronal

nuclear

protein
) и глиальных клеток (астроцитов)


ан
титела для
GFAP

(
glial

fibrillary

acidic

protein
). Как видно (Рис. 22
А
-
Б
), в области обонятельных луковиц,
ростро мигрционного тракта, субвентрикулярной зоны головного мозга, но не в
гиппокампе, у 100Р/100Р наблюдалось повышенное количество
GFAP
+ клеток
п
о сравнению с мышами дикого типа. В то время как не было обнаружено
межгенетических отличий по количеству
NeuN
+ нейрональных клеток во всех
исследованных областях мозга
.


Рис. 21.

А.

Иллюстративные срезы обонятельных луковиц, ростро миграц
и-
онного тракта, субвентрикулярной зоной,
субгранулярной зоны гиппокампа у
мышей дикого типа (+/+) и мутантов (100Р/100Р) на фоне введения физиол
о-
гического раствора (верхняя панель) и вальпроата (нижняя панель) иммун
о-
окрашенных с меткой
ki
67 (тёмно
-
коричневый цвет). Все изображения пол
у-
чены при ув
еличении х 10.
Б
. Количественный анализ числа
ki
67+ клеток в
обонятельных луковицах (ОЛ), ростро миграционном тракте (РМТ), субве
н-
трикулярной зоне (СВЗ), субгранулярной зоне гиппокампа (СГЗГ) у живо
т-
ных всех экспериментальных групп.
ОЛ
: [
F

(1,62) = 18.23;
p

0.01]


ген
о-
тип; [
F

(1,62) = 18.9;
p

0.01]


препарат; [
F

(1,62) = 19.4;
p

0.01]


генотип
х препарат взаимодействия.
РМТ
: [
F

(1,62) = 17.38;
p

0.01]


генотип; [
F

(1,62) = 28.47;
p

0.01]


препарат; [
F

(1,62) = 15.71;
p

0.05]


препарат х г
е-
нотип.
СВЗ
: [
F

(1,62) = 28.54;
p

0.01]


генотип; [
F

(1,62) = 16.28;
p

0.05]


препарат, [
F

(1,62) = 16.54; р < 0.01]


генотип х препарат.
СГЗГ
:
MANOVA

не выявил достоверных влияний генотипа, препарата и их взаимодействий на
число
ki
67+ клеток (
p

s


0.05). Число
ki
67+ клеток выражается как число
клеток на 1 мм2 используя программу
Aperio

Image

Scope
. *
-

p

0.05; **
-

p

0.01


по сравнению с мышами дикого типа (+/+) на фоне введения физ.
раствора; #
-

p

0.01


по сравнению с 100Р/100Р мутантами н
а фоне введ
е-
ния физ. раствора.
N

= 4 среза на 1 мышь; 4
-
6 мышей на группу.



Рис. 22.

Уровень

GFAP
+

клеток в отделах головного мозга у мышей дикого типа (+/+) и
100Р/100Р.

А

Б

36






Генетическая делеция
Lcn
2 ко
р
ректирует повышенное количество
GFAP
+
клеток и нормализует шизофреноподобное поведение у 100Р/100Р мутантных
мышей.


Для выяснения вклада
Lcn
2

гена в опосредование повышенного числа
глиальных клеток и ассоциацию с шизофреноподобным поведением 100Р/100Р
мышей, данная генетическая линия мышей

была скрещена с
Lcn
2 нокаутной
линией (
Lcn
2
-
KO
) (
Berger


al
.,

2006).





































А

Б

В



37







ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное комплексное исследование доказало вклад 2го эк
з
она гена
DISC
1

в патогенез шизофреноподобного состояния на впервые созданной ген
е-
тической линии мышей
DISC
1
-
L
100
P

(100Р/100Р). В результате точечной мут
а-
ции во 2м экзоне (
L
100
P
) нарушаются функциональные взаимодействия
DISC
1
с
PDE
4
B
,
GSK
-
3 и
D
2

рецепторами
, что в результате приводит к повышенной
чувствительности дофаминергической систе
мы головного мозга. В частности,
пониженное взаимодействие между
D
ISC
1
-
L
100
P
,
PDE
4
B

и
GSK
-
3 повышает
ферментативную активность
GSK
-
3, что нарушает формирование комплекса
DISC
1
c

D
2
рецепторами,

клатрином, АР2, β
-
арестином,
Akt
1, и усиливает вз
а-
имодействия
D
2

рецепторов

с
DISC
1, в результате чего снижается интернал
и-
зация
D
2 рецепторов, приводящая к повышенной чувствительности ДА сист
е-
мы мозга и патологическому поведению

у

100
P
/100Р

мышей. Селективное ра
з-
мыкание усиленных взаимодействий
между
DISC
1

и
D
2

рецепторов

с помощью
синтезированного
пептида (
ТАТ
-
D
2рер
)
, оказывало антипсихотический эффект
на шизофреноподобное поведение
100Р/100Р

мышей. Дополнительно, фарм
а-
кологические блокаторы
GSK
-
3 и
PD
Е4
B

также оказывали антипсихотическое
действие на 100
P
/100Р

модел
ь

шизофрении. Следовательно, исследования
DISC
1 и его интерактома представляют перспективное направление как с ц
е-
лью фундаментального понимания молекулярных механизмов шизофрении, так
и для создания новых биомаркеров шизофрении и антипсихотиков, что в

дал
ь-
нейшем может быть транслировано в область клинических исследований.

Поиск надежных биомаркеров шизофрении для ранней диагностики и
разработка превентивной терапии данного заболевания является актуальной з
а-
дачей в области психофармакологии. Проявлению

шизофреноподобного пов
е-
дения у взрослых 100
P
/100Р мышей предшествуют молекулярно
-
клеточные и
з-
менения на более ранних этапах нейроразвития. Прогресс симптомов заболев
а-
ния с возрастом у 100Р/100Р происходит на фоне повышенной генетической
экспрессии
Lcn
2

в
головном мозге, сопровождающийся активацией пролифер
а-
ции астроцитов в области ростро
-
миграторного тракта и обонятельных лук
о-
виц, негативно коррелирующих с сенсорно
-
моторной фильтрацией
-

классич
е-
ским эндофенотипом шизофрении. Превентивное введение вальпроа
та до м
а-
нифестации шизофреноподобного поведения подавляло экспрессию
Lcn
2
, к
о-
Рис. 23
.
А.

Генетическая инактивация
Lcn
2 корректировала повышенное число
GFAP
+ клеток в
субвентрикулярной

зоне (СВЗ)
у 100Р/100Р мутантных мышей.
Конфокальная нейровизуализация срезов СВЗ с иммуноокрашиванием, испол
ь-
зуя антитела к
Lcn
2 и
GFAP

у мышей 4х генотипов: дикий тип (+/+
-
+/+);
100Р/100Р
-
+/+; +/+
-
Lcn
2
-
KO
; 100Р/100Р
-
Lcn
2
-
KO

(
N

= 4 среза на 1 мышь; 3
-
5
м
ышей на генотип, увеличение х20.
Б
.

Количественный анализ уровня экспре
с-
сии
Lcn
2 и
GFAP

в СВЗ у мышей 4х генотипов. *
-

p

0.05; **
-

p

0.01


по
сравнению с +/+ мышами, непарный
t
-
тест.

В
. Дефицит престимульного торм
о-
жения у 100Р/100Р корректировала ге
нетическое отсутствие
Lcn
2
. *
-

p

0.05; **
-

p

0.01; ***
-

p

0.001
-

по сравнению с +/+ мышами.


38






личество глиальных клеток и как следствие, нормализовало шизофреноподо
б-
ное поведение
у

100Р/100Р

мышей
, свидетельствуя о пластичности нервной с
и-
стемы. Наконец, создание гибридной
модели шизофрении, сочетая патогенный
фактор окружающей среды


МИА, и генетическую предрасположенность


100Р/
+
, позволило доказать вклад ИЛ
-
6 в патологические механизмы шизофр
е-
нии.

Таким образом, комплексное исследование на 100
P
/100Р генетической
линии
мышей позволяет заключить, что данная линия мышей является перспе
к-
тивной моделью шизофрении, исследования на которой позволят выявить н
о-
вые молекулярно
-
клеточные и нейробиологические механизмы данного забол
е-
вания, что приведет к идентификации новых биомарк
еров шизофрении, а также
мишеней для превентивных и терапевтических воздействий.







Рис. 24.

Схема, иллюстрирующая основные результаты, полученные в ходе в
ы-
полнения диссертационной работы.




39






ВЫВОДЫ


1.

Генетическая линия мышей 100Р/100Р с точечной мутацией во 2м экзоне
гена
DISC1
, соответствует основным критериям экспериментальной м
о-
дели шизофрении: этиологии, сходству симптомов; нейробиологическим
изменениям и специфическому терапевтическому ответу на а
нтипсих
о-
тические препараты.

2.

Точечная мутация
DISC
1
Rgsc
1390

нарушает межбелковые взаимодействия
DISC
1
-
L
100
P

с дофаминовыми
D
2 рецепторами, что приводит к гипера
к-
тивации дофаминергической

системы головного мозга, проявляющейся в
повышенной фармакологической чувствительности к амфетамину, ув
е-
личении количества высокочувствительных дофаминовых
D
2 рецепт
о-
ров, что приводит к м
анифестации шизофреноподобного поведения у
100Р/100Р линии мышей
.

3.

В

основе биохимических механизмов шизофреноподобного поведения
лежит нарушение
межбелковых взаимодействий
DISC
1
-
L
100
P

протеина с
GSK
-
3,
PDE
4
B

и
D
2 рецепторами
. Коррекция повышенной активности
GSK
-
3,
PDE
4
B
, а также усиленных межбелковых
взаимодействий

между
DISC
1 и
D
2 рецепторами
, оказывает антипсихотический эффект на ш
и-
зофреноподобное поведение 100
P
/100Р мутантных мышей.

4.

Патогенный фактор окружающей среды, материнская иммунная актив
а-
ция, взаимодействует с генетической предрасположенностью к шизофр
е-
ноподобно
му поведению, провоцируя данный тип психопатологии у г
е-
терозиготных 100Р/
+

мышей, что подтверждает патогенность
DISC
1
Rgsc
1390

мутации. Материнская иммунная активация посредством прово
с-
палительного

цитокина интерлейкина
-
6 вызывает шизофреноподобное
поведение у 100P/
+
гетерозиготных мышей.

5.

Глиатрансмиттер липокалин
-
2 вовлечён в нейроглиальные механизмы
шизофреноподобного поведения на стадии раннего развития и в преве
н-
тивный эффект вальпроата.

6.

Точеч
ная мутация
DISC
1
Rgsc
1390

нарушает функциональные свойства
N
-
конца
DISC
1 протеина и
DISC
1 интерактома, что приводит к дисбалансу
дофаминергической системы, патогенному нейроразвитию и манифест
а-
ции шизофреноподобного поведения у мышей, свидетельствуя о вкл
аде
DISC
1 в дофаминергическую теорию шизофрении и теорию нейроразв
и-
тия.

7.

Биохимические и фармакологические исследования на основе нарушений
DISC
1
-
L
100
P

интерактома предлагают межбелковые взаимодействия
DISC
1
c

D
2 рецепторами,
GSK
-
3 и
PDE
4 как перспективные

мишени для
диагностики и создания антипсихотиков нового поколения.

40






Основные положения диссертационной работы изложены

в следующих публикациях:

Книга

1.

Drug Discovery on Schizophrenia. Eds: TV Lipina & JC Roder, RSC Publis
h-
ing.
2015.
P. 289.
DOI:
10.1039/9781782622499


Главы в книгах

1.

Lipina T.V., Roder J.C. Disrupted
-
In
-
Schizophrenia
-
1 (DISC1) interactome
and schizophrenia.
-

D
rug Discovery on Schizophrenia.
Eds: T
.
V
.

Lipina

&
J
.
C
.

Roder, RSC Publishing
,

2
015
.
P
.141
-
172


2.

Lipina T and Roder

JC. The Genetic Component of Latent Inhibition: Studies
of Inbred and Mutant Mice.
-

Latent Inhibition: Data, Theories, and Applic
a-
tions to Schizophrenia, Eds R.E. Lubow & Ina Weiner, Cambridge University
Press, 2010
.

P
. 225
-
251

3.

Lipina TV
, Clapcote

SJ
, M
illar

K
, Gondo

Y
, Porteous

DJ
, Roder

JC
. Impaired
function of phosphodiesterase 4B in mutated Disc1 mice leads to development
of pronounced depression
-
like behavior with mild expression of schizophrenia
-
like phenotype.
-
Be
havioral models in Stress Research
, Ed
:

A.
V. Kalueff,

Nova
Science Publishers, Inc., 2007,
P
. 165
-
189


Статьи в журналах

1.

Clapcote SJ, Lipina TV, Millar KJ, Mackie S, Christie S, Ogawa F, Lerch JP,
Trimble K, Uchiyama M, Sakuraba Y, Kaneda H, Shiroishi T, Houslay MD, He
n-
kelman

RM, Sled JG, Gondo Y, Porteous DJ, Roder JC. Behavioral phenotypes of
Disc1 missense mutations in mice.
//
Neuron
.

2007
.

V
.
54
.

3
.
P
.

387
-
402
.

2.

Kaidanovich
-
Beilin

O
,
Lipina

T
,
Keizo

T
,
Eed

M
,
Satoko

H
,
Lalibert
é
C
,
Khan

M
,
Okamoto

K
,
Chambers

JW
,

PJ
,
MacAulay

K
,
Doble

B
,
Henkelman

M
,
Miyakawa

T
,
Roder

JC
,

JR
.
Abnormalities in brain structure and beha
v-
ior in GSK
-
3 mutant mice. //Molecular Brain. 2009,
V
.
2
.
P
.
35.

3.

Lipina TV,

Niwa M, Jaaro
-
Peled H, Fletcher PJ, Seeman P, Sawa A, Roder JC.

Enhanced dopamine function in DISC1
-
L100P mutant mice: Implications for
schizophrenia //Genes, Brain and Behavior.
2010,
V
.
9
. №
7
.
P
.

777
-
789.


4.

Lipina TV, Roder J. A New model of the disrupted Latent Inhibition in C57BL/6J
mice after treatment with bupropi
on. //Psychopharmacology, 2010,
V
.
208.

3
.

P
.
487
-
498
.


5.

latent inhibition in mouse inbred strains. //Pharmacology, Biochemistry and B
e-
haviour, 2011
.
V
.

100
. №
2
.
P
.

244
-
252
.

6.

Kaidanovich
-
s-
sessment of social interactions behaviors. //J Vis Exp. 2011.
V
.48.
P
.

2473.

7.

Lipina TV, Kaidanovich
-
Beilin, O, Patel, S, Wang, M, Clapcote, SJ, Liu, F,
The interaction of DISC1 and GSK
-
3 is impaired in
the Disc1
-
L100P mutant mice. //Synapse. 2011
.

V
.
65
. №
3
.
P
.

234
-
248.


8.

Lipina TV, Roder J.
-
3: pha
r-
macological evidences on DISC1 mutant mice.
//Neuropharmacology, special i
s-
sue on Schizophrenia. 2012
.

V
.
62
. №
3
.
P
. 1
252
-
1256
.


41






9.

Haque FN, Lipina TV, Roder JC, Wong AH.
Social defeat interacts with Disc1
mutations in the mouse to affect beh
avior.

//
Behav Brain Res
. 2012
.

V
.
233
. №
2
.
P
.

337
-
344
.


10.

Lipina TV, Haque FN,

McGirr A,

Boutros P, Thorsten Berger, Tak W Mak, Roder
JC.

Wong AHC.
Prophylactic valproic acid treatment prevents schizophrenia
-
related behaviour in Disc1
-
L100P mutant mice. //
PLoS One
.

2012
.
V
.

7
. №
12
.
P
.
e51562

11.

Lipina TV, Martinez A, Roder JC. Dual inhibitor of PDE7 and GSK
-
3


VP1.15
acts as antipsychotic and cognitive enhancer in C57BL/6J mice.
//Neuropharmacology, special issue on Cognitive Enhancers. 2013
.
V
.
64
. №
1
.
P
.

205
-
214

12.

Lipina TV, Zai C, Hlousek D, Roder JC, Wong AHC. Maternal immune activation
during gestation interacts with Disc1 point mutation to exacerbate schizophrenia
-
related behaviors in mice. //The Journal of Neuroscience. 2013
.

V
.
33
. №
18
.
P
.

7654
-
7666
.

13.

Su P, Li S, Chen S, Lipina TV, Wang M, Lai TK, Lee FH, Zhang H, Zhai D, Fe
r-
A dopamine D2
receptor
-
DISC1 protein complex may contribute
to antipsychotic
-
like effects.

Neuron. 2014
.
V
.

84
. №
6
.
P
.
1302
-
1316
.


14.

Lipina TV, Roder JC. Disrupted
-
In
-
Schizophrenia
-
1 (DISC1) interactome and
mental disorders: impact of mouse models. //Neuroscience and BioBehavioral R
e-
views.
2014
.

V
.
45
.
P
.
271
-
294

15.

Lipina

TV
, Jekielek

M
, Beregovoy

NA
, Starostina

MV
, Palomo

V
, Perez

DI
, Ma
r-
tinez

A
, Roder

JC
. Inhibition of glycogen synthase kinase 3 prevents synaptic
long
-
term depression and facilitates cognition in C57BL/6J mice. //Opera Medica
& Physiologica.
2016.
V
.2.
P
. 10
-
25.



Приложенные файлы

  • pdf 26320270
    Размер файла: 2 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий